يسمح هذا البروتوكول بإعادة بناء 3D للعضيات بطريقة بسيطة وقوية ، في حين يمكن الوصول إليها من قبل المختبرات التي ليس لديها حاليا مجاهر إلكترونية متخصصة في الحجم. هذه التقنية مرنة للغاية ، وتوفر دقة X / Y ممتازة ، مع القدرة على إعادة تصوير العينات إذا لزم الأمر. كما أنه متوافق مع التصوير المقطعي بالإمالة عند الحاجة إلى دقة Z عالية جدا.
تسمح هذه التقنية باستجواب مورفولوجيا العضيات في سياق بين العضيات. لذلك ، يمكن توسيعه لفحص أي حالات مرضية مع عيوب العضيات. يمكن أن يوفر هذا النهج نظرة ثاقبة على تفاعلات العضيات وأحداث الاتجار الخلوي.
يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على الأنسجة الأخرى والنماذج العضوية وأنظمة زراعة الخلايا ، بالإضافة إلى خلايا الكبد. قد يجد المستخدمون لأول مرة التقسيم التسلسلي ويلتقطون تحديا دون خسارة. يوصى بإتقان التقسيم المنتظم الرقيق للغاية قبل تطبيق هذا البروتوكول على عينة ثمينة.
ابدأ بتقليم الأنسجة المضمنة في الراتنج بعناية باستخدام شفرة حلاقة مع قفل العينة في محول التشذيب. انقل تابوت العينة مع الظرف والعينة إلى ذراع العينة للميكروتوم وضع تابوت العينة بحيث يمتد نطاق سفر الفلك من الأعلى إلى الأسفل. ضع السكين الماسي واقفله في حامل السكين ، مما يضمن ضبط زاوية قطع السكين بشكل مناسب.
قفل حامل السكين في المسرح بإحكام. قم بإيقاف تشغيل إضاءة المرحلة الهابطة ، وقم بتشغيل إضاءة المسرح ، وحرك السكين بحذر نحو العينة ، واضبط باستمرار الزاوية الجانبية للسكين ، وإمالة العينة ، ودوران العينة عن طريق ضبط المقابض ذات الصلة حتى يتم محاذاة وجه الكتلة إلى حافة السكين. اضبط الجزء العلوي والسفلي من نافذة القطع لذراع العينة واترك العينة أسفل حافة السكين مباشرة.
املأ قارب السكين بالماء النظيف المقطر المزدوج وتأكد من أن سطح الماء مستو مع حافة السكين ومقعر قليلا. ثم ابدأ في قطع الأقسام. أوقف القطع مباشرة بعد اجتياز العينة لحافة السكين.
استخدم شبكة فتحات فارغة لتقدير عدد المقاطع المطلوب تجميعها على كل شبكة. باستخدام رمش في كل يد، قم بكسر الشريط برفق إلى شرائط أصغر يمكن أن تتناسب مع طول شبكة الفتحة. قم بتدوين ملاحظة ذهنية لمواقعهم النسبية داخل العينة.
باستخدام قضيب قضيب زجاجي ، مرر قطرة من الكلوروفورم فوق الأقسام لتسطيحها. التقط أول شبكة فتحة فارغة باستخدام أول ملقط مرقم واغمسها بلطف في Triton X-100 ثم مرتين في الماء المقطر. استخدم قطعة من ورق الترشيح لإزالة الماء الزائد من حافة الملقط.
باستخدام الملقط ، قم بخفض ما يقرب من 2/3 من شبكة الفتحات المطلية بالفورمفار بلطف في مياه قارب السكين. تأكد من أن جانب الفورمفار متجه لأسفل وأن الحافة اليمنى الطويلة للفتحة موجودة على سطح الماء وموازية لحافة الماء. قم بتحريك الشبكة بلطف في الماء نحو الشرائط بحيث تنجرف الأقسام نحو الشبكة عند ضربة العودة.
استمر في القيام بذلك في الفتحات الأصغر والأصغر، حتى تصطف الحافة اليمنى للشريط مع الحافة اليمنى للفتحة. ثم ، مع آخر لوح ، أحضر الشبكة برفق لالتقاط الأقسام في شبكة الفتحة. ضع عدة كريات من هيدروكسيد الصوديوم تحت غطاء طبق بتري لتوفير بيئة خالية من ثاني أكسيد الكربون.
ثم ، ماصة بعناية قطرات 40 ميكرولتر من سيترات الرصاص رينولد على بارافيلم ، قطرة واحدة لكل شبكة. اقلب كل شبكة على قطرة سترات الرصاص واتركها محمية بغطاء طبق بتري لمدة 7 إلى 10 دقائق. بينما تكون الشبكات ملطخة ، ضع خمس قطرات من الماء المقطر حوالي 300 ميكرولتر لكل شبكة على البارافيلم.
في نهاية حضانة سيترات الرصاص ، انقل كل شبكة إلى قطرة من الماء المقطر لغسلها لمدة دقيقة واحدة دون التنفس مباشرة على الشبكات. كرر هذا أربع مرات أخرى. استخدم ملقط كروس أوفر مرقم لالتقاط الشبكة الأولى.
المس حافة الشبكة لتصفية الورق لإطفاء معظم الماء واتركه حتى يجف في الملقط لمدة 20 دقيقة على الأقل. كرر ذلك لكل شبكة. عند التكبير المنخفض، راقب ترتيب الأقسام التسلسلية وموقعها وموضعها.
انتقل إلى القسم الأوسط من السلسلة على الشبكة. تصفح العينة وحدد منطقة الاهتمام. ثم راقب العينة عند التكبير المطلوب.
فكر في جمع السلسلة بتكبير أقل قليلا، حيث غالبا ما لا تكون الأقسام محاذاة تماما، وقد تحتاج الصور إلى اقتصاصها لاحقا. بعد ذلك، التقط صورا مرجعية بتكبيرات أقل. سيساعد ذلك على تقدير سياق المنطقة ذات الاهتمام ، وموقعها التقريبي عند تكبيرات مختلفة فيما يتعلق بحدود القسم ، والميزات البارزة داخل العينة.
استخدمها لوضع علامة على منطقة الاهتمام في أقسام أخرى. للرجوع إلى الشاشة، استخدم معجون لاصق قابل لإعادة الاستخدام أو ملصقات أو قطعة من ورق العرض العلوي المسجل على الشاشة لوضع علامات مؤقتة على الشاشة. سيسمح ذلك بإعادة التصور الروتيني لنفس ميزات المنطقة ذات الاهتمام في مركز الصورة في جميع أنحاء مجموعة البيانات.
افتح مكدس الصورة، وحدد قياسات voxel، وحدد علامة التبويب تجزئة لبدء التجزئة. انقر جديد في لوحة محرر التقسيم لتعريف كائنات جديدة في قائمة المواد. انقر بزر الماوس الأيمن لتغيير لون الكائن وانقر نقرا مزدوجا لإعادة تسمية الكائن.
للتجزئة اليدوية، اختر أداة التقسيم أسفل قائمة المواد وحدد أداة الفرشاة الافتراضية لتمييز البيكسلات. تظهر هنا صورة المجهر الإلكتروني لخليتين كبيتين متعارضتين. يسمح التصوير بالتكبير العالي بمراقبة التفاصيل المورفولوجية للعضيات المختلفة بدقة نانومترية.
تظهر الصورة التمثيلية النسخة المجزأة من نفس التصوير المقطعي ، وأثر الشبكة الإندوبلازمية ، والميتوكوندريا ، والاتصالات بين الأغشية بين ER والميتوكوندريا من مساحات مختلفة تظهر هنا. تظهر الصورة التمثيلية شريحة أورثو مائلة متراكبة مع آثار التجزئة وموقعها النسبي داخل الميتوكوندريا بأكملها. ويظهر هنا إعادة بناء 3D للعضيات المجزأة والاتصالات الشبكية والميتوكوندريا الإندوبلازمية بزوايا مختلفة.
نظرا لأن هذا البروتوكول متوافق مع التصوير المقطعي بالإمالة عند الحاجة إلى دقة Z عالية جدا ، فإنه يساعد على حل الهياكل الصغيرة أو المعقدة. هذه التقنية مثالية للتقييم الأولي للعلاقة المكانية بين العضيات المختلفة ، وبالتالي ، فهي مفيدة بشكل خاص في مجال التقدم في اتصالات الغشاء في توازن الغشاء.
