Este protocolo muestra cómo se utiliza la técnica de cortina de ADN para estudiar la dinámica de la cromatina, en particular para investigar la función molecular de las chaperonas de histonas. La cortina de ADN de la técnica de adquisición de imágenes de molécula única de alto rendimiento supera las limitaciones de los experimentos masivos y facilita la obtención de imágenes en tiempo real, lo que permite la caracterización detallada de las interacciones de las biomoléculas. Coloque un papel limpio de dimensión 5 por 35 milímetros en el centro de la cinta adhesiva de doble cara.
Pega la cinta adhesiva sobre el portaobjetos para cubrir los dos agujeros y los nanopatrones con el papel. A continuación, extirpe el papel con una cuchilla limpia. Coloque un cubreobjetos de vidrio encima de la cinta adhesiva de doble cara y frote el cubreobjetos con la punta de una pipeta para formar una cámara microfluídica.
Coloque la celda de flujo ensamblada entre dos portaobjetos de microscopio y sujételos. Hornee la celda de flujo en un horno al vacío a 120 grados centígrados durante 45 minutos. Fije el conector de fluido para el análisis basado en virutas a cada orificio abierto con una pistola de pegamento caliente.
Y conecte las dos líneas de tubos de bloqueo de señuelo. Conecte una jeringa de bloqueo de señuelo que contenga tres mililitros de agua desionizada y lave la cámara. Lavar de nuevo la cámara con tres mililitros de tampón lipídico a través de la conexión gota a gota.
Inyectar un mililitro de lípido biotinilado 0,04x en tampón lipídico, en la cámara, en dos tomas, con una incubación de cinco minutos por toma. Inyecte 0,025 miligramos por mililitro de estreptavidina en un mililitro de BSA, con dos inyecciones y una incubación de 10 minutos por inyección. Inyecte aproximadamente 30 picomolares de ADN de fagos lambda biotinilados en un mililitro de tampón BSA, en la cámara con dos disparos e incubaciones de 10 minutos por disparo.
Conecte una jeringa que contenga 10 mililitros de tampón de imágenes a una bomba de jeringa y elimine las burbujas en todas las líneas de tubería del sistema microfluídico. Acople la celda de flujo preparada con el sistema microfluídico a través de una conexión gota a gota para evitar la inyección de burbujas en la celda de flujo. Ensamble la celda de flujo y los soportes de la celda de flujo, y monte el ensamblaje en un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total hecho a medida.
Inyecte 200 microlitros de colorante YOYO-1 en tampón de imagen a través de 100 microlitros de bucle de muestra para teñir las moléculas de ADN Lambda. Ejecute un software de imágenes y encienda el láser de 488 nanómetros para verificar si las cortinas de ADN están bien formadas. Después de eliminar el colorante YOYO-1, inyecte la muestra de proteína preincubada.
Cuando las proteínas lleguen a la cortina de ADN, apague la bomba de jeringa, cierre la válvula de cierre e incube durante 15 minutos para la carga de histonas por Abo1. Lave las proteínas Abo1 e histonas no unidas durante cinco minutos. Apague transitoriamente el flujo de tampón para verificar si las proteínas histonas están cargadas en el ADN.
La formación de la cortina de ADN se comprobó tiñendo las moléculas de ADN con un colorante interpolador. Las líneas verdes mostradas en matrices paralelas indicaban que YOYO1 intercalado en moléculas de ADN estaban bien alineadas y estiradas en una barrera de difusión bajo flujo hidrodinámico. Cuando se inyectaron dímeros Cy5-H3-H4 en la cortina de ADN en ausencia de Abo1, Cy5-H3-H4 no se unió al ADN, lo que indica una falta de unión espontánea de los dímeros H3-H4 al ADN.
Cuando Cy5-H3-H4 se inyectó con Abo1, se observaron puntos fluorescentes rojos en las moléculas de ADN, lo que sugiere que Abo1 carga dímeros H3-H4 en el ADN. Las señales fluorescentes desaparecieron en ausencia de flujo tampón y reaparecieron cuando se reanudó el flujo, lo que sugiere que los dímeros H3-H4 se unen al ADN. La unión de los dímeros H3-H4 al ADN también fue confirmada por el quimógrafo, en el que las señales de fluorescencia desaparecían cada vez que se cortaba el flujo.
Aparecieron pocos puntos fluorescentes en la cortina de ADN, ya sea en ausencia de nucleótido o en presencia de ADP, lo que indica que los dímeros H3-H4 rara vez se unen al ADN, ya sea en el estado Apo o en presencia de ADP. El análisis cuantitativo muestra que el número de dímeros H3-H4 unidos al ADN aumenta en presencia de ATP. Los resultados sugieren que la hidrólisis de ATP es esencial para la carga de H3-H4 en el ADN por Abo1.
Evitar la inyección de burbujas en la celda de flujo es lo más crítico para todos los pasos. Por lo tanto, en este protocolo, hacemos hincapié en las conexiones gota a gota. El ensayo de cortina de ADN se puede extender a cortinas de ADN de doble amarre con nanopatrones duales.
Además, podemos hacer otro tipo de cortina de ADN con filamentos monocatenarios de ADN, ARN o actina. La cortina de ADN permite la visualización del movimiento de las proteínas en el ADN y facilita el estudio del mecanismo de búsqueda de objetivos. La cortina de ADN se puede extender para estudiar el metabolismo del ADN, incluida la replicación y la transcripción.
