Se ha demostrado que la dinámica global de la cromatina es un mediador importante de varios estados de enfermedad, como el cáncer y el envejecimiento. Nuestro protocolo proporciona un modelo fisiológicamente relevante para estudiar este proceso. El análisis de laboratorio estándar de modificaciones post-traduccionales de histonas o PTMS generalmente se limita a sondear un solo PTM a la vez utilizando ensayos basados en anticuerpos.
El análisis de espectrometría de masas por cromatografía líquida de histonas PTMS nos permite medir la abundancia de cientos de PTMS en un solo experimento. Demostrando el procedimiento estarán Stephanie Stransky, Ronald Cutler y Julie Kim, un postdoctorado, estudiante de posgrado y técnico de investigación, respectivamente, del laboratorio. Primero, utilizando medios de crecimiento estándar, haga crecer las células como una monocapa hasta que sean 80% confluentes.
Luego lave las células con HBSS. Añadir cinco mililitros de tripsina-EDTA al 0,05% diluida en HBSS. Incubar las células durante cinco minutos a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
Use un microscopio para verificar el desprendimiento celular. Después de contar las células, diluya la suspensión celular con medios de crecimiento frescos. Agregue 0.5 mililitros de medios de crecimiento para equilibrar una placa inferior redonda de 24 pocillos de fijación ultra baja con múltiples micropocillos en cada uno.
Luego centrifugue las placas a 3000 x g para eliminar las burbujas de aire de la superficie de la placa. Ahora transfiera la suspensión celular previamente hecha a la placa de 24 pocillos y la centrífuga durante tres minutos a 120 x g. Revise las células en la placa de 24 pocillos y luego incube las placas a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas para la formación de esferoides.
Mientras tanto, para equilibrar el biorreactor, agregue 25 mililitros de agua estéril a la cámara de humedad y nueve mililitros de medios de crecimiento a la cámara celular. Incubar el biorreactor en una incubadora de clinostat giratoria durante 24 horas a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Separe los esferoides de la placa de 24 pocillos de fijación ultra baja mediante pipeteos suaves con puntas de orificio de un mililitro de ancho y transfiéralos a un plato de cultivo de tejidos.
Para seleccionar suficientes formas de esferoides, verifique la calidad de los esferoides bajo un microscopio. Los esferoides de buena calidad tienen un tamaño, compacidad y redondez uniformes. Llene el biorreactor equilibrado con cinco mililitros de medios de crecimiento frescos y transfiera los esferoides a él.
Luego llene el biorreactor completamente con medios de crecimiento frescos y coloque el biorreactor en la incubadora de clinostat a 10 a 11 RPM. Cada dos o tres días, intercambie medios de crecimiento reemplazando 10 mililitros de medios antiguos con medios frescos. A medida que estos esferoides aumentan en tamaño y número, aumente la velocidad de rotación de la incubadora.
Después de obtener el pellet esferoide, agregue cinco volúmenes de ácido sulfúrico molar 0.2 frío al pellet y pipetee hacia arriba y hacia abajo para interrumpir el pellet y liberar histonas. Una vez que se obtiene el sobrenadante después de la centrifugación, agregue ácido tricloroacético concentrado en frío, de modo que la concentración final se convierta en 25 a 30% volumen por volumen. Y mezclarlo invirtiendo el tubo un par de veces y centrifugando como se describe en el manuscrito.
Después de desechar el sobrenadante, usando una pipeta de pasto de vidrio, lave el pellet y las paredes del tubo con aproximadamente 500 microlitros de acetona fría y ácido clorhídrico al 0.1%, y luego centrifugue a 3, 400 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Luego voltee el tubo para desechar el sobrenadante. Usando una pipeta de pasto de vidrio, agregue 500 microlitros de acetona 100% fría para lavar el pellet y la centrífuga como se demostró anteriormente.
Después de desechar el sobrenadante, retire completamente la acetona pipeteando con cuidado y deje que la muestra se seque con una tapa abierta durante unos 20 minutos. Resusped el pellet en 20 microlitros de 15 a 20% de acetonitrilo en un bicarbonato de amonio 100 milimolar de pH 8. Después del vórtice, gire hacia abajo la suspensión a 1000 x g durante 30 segundos.
Para ocho o más muestras, transfiera cada muestra re suspendida a una placa de 96 pocillos. Luego, en una campana, agregue dos microlitros de anhídrido propiónico y mezcle pipeteando cinco veces. Agregue rápidamente 10 microlitros de hidróxido de amonio y mezcle mediante pipeteo cinco veces.
Mezcle la resina HLB en una placa de agitación magnética. Luego agregue 70 microlitros de la suspensión HLB a cada pozo de una placa de filtro de 96 pocillos en una placa de recolección de 96 pocillos. Después de desechar el flujo, lave la resina con 100 microlitros de ácido trifluoroacético al 0,1%.
Después de resuspender cada muestra en 100 microlitros de ácido trifluoroacético al 0,1%, cargue cada muestra en cada pozo y evite salpicaduras utilizando un vacío. Después de desechar el flujo, lave las muestras con 100 microlitros de ácido trifluoroacético al 0,1% y coloque la placa de filtro en una nueva placa de recolección. A continuación, agregue 60 microlitros de 60% de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0.1% a cada pozo y evite salpicaduras usando vacío.
Recoge el flujo y sécalo a gran velocidad. Cargue la placa de recolección seca en el HPLC y ejecute el método LC/MS/MS como se describe en el manuscrito. En este estudio, se observó la abundancia relativa de modificaciones post-traduccionales de histonas comunes en hepatocitos C3A cultivados como esferoides tridimensionales.
También se pudieron observar modificaciones post-traduccionales en un solo residuo en péptidos generados a partir de proteínas histonas. El tratamiento de los esferoides con butirato de sodio aumentó la abundancia relativa de acetilación de histonas, mientras que el tratamiento con succinato de sodio mejoró la succinilación de residuos de histonas. El método también demostró el patrón de distribución de la acetilación de histonas después del tratamiento con butirato de sodio y el de la succinilación de histonas después del tratamiento con succinato de sodio.
El resultado también mostró patrones comunes de diferentes modificaciones de histonas. Los tratamientos con butirato de sodio mejoraron significativamente la acetilación del residuo de lisina 14 en un péptido generado a partir de la proteína histona H3, solo cuando su noveno residuo de lisina tenía dos grupos metilo, pero no uno o tres grupos metilo. También se calcularon las abundancias relativas de modificaciones individuales y varias combinaciones de modificaciones post-traduccionales en el péptido derivado de H3.
También se observaron patrones combinatorios de modificaciones post-traduccionales después del tratamiento con butirato de sodio en un péptido generado a partir de la proteína histona H4. Aquí también, el tratamiento con butirato de sodio resultó en un aumento significativo de la acetilación. Se debe prestar especial atención a mantener los esferoides en el banco lo menos posible y en un paso de desalinización para evitar el derrame de muestras. Este flujo de trabajo se puede utilizar para explorar la cromatina en tejidos sólidos utilizando un modelo más fisiológico que los cultivos de células planas de replicación rápida.
