グローバルなクロマチンダイナミクスは、がんや加齢などのいくつかの疾患状態の重要なメディエーターであることが示されています。私たちのプロトコルは、このプロセスを研究するための生理学的に関連するモデルを提供します。ヒストン翻訳後修飾またはPTMSの標準的な実験室分析は、通常、抗体ベースのアッセイを使用して一度に1つのPTMについてプロービングすることに限定される。
ヒストンPTMSの液体クロマトグラフィー質量分析により、1回の実験で数百のPTMSの存在量を測定することができます。手順を実演するのは、ステファニー・ストランスキー、ロナルド・カトラー、ジュリー・キム、それぞれ研究室のポスドク、大学院生、研究技術者です。まず、標準的な増殖培地を用いて、細胞を80%コンフルエントになるまで単層として増殖させる。
その後、HBSSで細胞を洗浄する。HBSSで希釈した5ミリリットルの0.05%トリプシン-EDTAを加える。細胞を5%の二酸化炭素で摂氏37度で5分間インキュベートする。
顕微鏡を使用して細胞の剥離を確認します。細胞を計数した後、細胞懸濁液を新鮮な増殖培地で希釈する。0.5ミリリットルの成長培地を加えて、それぞれに複数のマイクロウェルを有する超低付着24ウェル丸底プレートを平衡化する。
次いで、プレートを3000 x gで遠心分離し、プレートの表面から気泡を除去した。次に、以前に作製した細胞懸濁液を24ウェルプレートに移し、120 x gで3分間遠心分離する。24ウェルプレート内の細胞を確認し、スフェロイド形成のためにプレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。
一方、バイオリアクターを平衡化するために、25ミリリットルの滅菌水を湿度チャンバーに、9ミリリットルの成長培地を細胞チャンバーに加える。バイオリアクターを回転式クリノスタットインキュベーター内で、摂氏37度で5%の二酸化炭素で24時間インキュベートします。1ミリリットル幅のボアチップを用いて穏やかにピすることにより、超低付着24ウェルプレートからスフェロイドを剥離し、組織培養皿に移す。
十分に形成されたスフェロイドを選択するには、顕微鏡下でスフェロイドの品質を確認してください。良質の回転楕円体は、均一なサイズ、コンパクトさ、および真円度を有する。平衡化したバイオリアクターを5ミリリットルの新鮮な成長培地で満たし、スフェロイドをその中に移す。
次いで、バイオリアクターを新鮮な成長媒体で完全に満たし、バイオリアクターをクリノスタットインキュベーターに10〜11RPMで入れる。2〜3日ごとに、10ミリリットルの古いメディアを新しいメディアに置き換えて、成長メディアを交換します。この回転楕円体のサイズと数が増えるにつれて、インキュベーターの回転速度を上げます。
回転楕円体ペレットを得た後、ペレットに5倍量の冷たい0.2モル硫酸を加え、ピペットを上下にしてペレットを破壊し、ヒストンを放出する。遠心分離後に上清が得られたら、最終濃度が体積比で25〜30体積%になるように、冷濃縮トリクロロ酢酸を加える。そして、原稿に記載されているようにチューブを数回反転させ、遠心分離機で混合します。
上清を捨てた後、ガラス牧草地ピペットを用いて、ペレットおよびチューブの壁を約500マイクロリットルの冷アセトンおよび0.1%塩酸で洗浄し、次いで3,400 x gで摂氏4度で5分間遠心分離する。その後、チューブをひっくり返して上清を捨てる。ガラスの牧草地ピペットを使用して、500マイクロリットルの100%冷アセトンを加えてペレットを洗浄し、前述のように遠心分離機で洗浄します。
上澄み液を捨てた後、丁寧にピしてアセトンを完全に除去し、開いた蓋で約20分間試料を乾燥させた。ペレットを20マイクロリットルの15〜20%のアセトニトリル中にpH8の100ミリモルの炭酸水素アンモニウムに再懸濁する。ボルテックスの後、サスペンションを1000 x gで30秒間スピンダウンします。
8つ以上のサンプルについて、各再懸濁サンプルを96ウェルプレートに移す。次に、フードに、2マイクロリットルの無水プロピオン酸を加え、ピにより5回混合する。水酸化アンモニウム10マイクロリットルを素早く加え、ピで5回混合する。
HLB樹脂をマグネチックスタープレート上で混合する。次いで、70マイクロリットルのHLB懸濁液を、96ウェル収集プレート上の96ウェルフィルタープレートの各ウェルに加える。フロースルーを破棄した後、100マイクロリットルの0.1%トリフルオロ酢酸で樹脂を洗浄する。
各サンプルを100マイクロリットルの0.1%トリフルオロ酢酸に再懸濁した後、各サンプルを各ウェルにロードし、真空を使用して飛散を防ぎます。フロースルーを廃棄した後、100マイクロリットルの0.1%トリフルオロ酢酸でサンプルを洗浄し、フィルタープレートを新しい収集プレートの上に置いた。次に、0.1%トリフルオロ酢酸に60%アセトニトリル60マイクロリットルを各ウェルに加え、真空を使用して飛沫を防ぎます。
流れを集め、速度真空中で乾燥させる。乾燥した収集プレートをHPLCにロードし、原稿に記載されているようにLC/MS/MS法を実行します。この研究では、三次元スフェロイドとして増殖したC3A肝細胞において、一般的なヒストン翻訳後修飾の相対的存在量が観察された。
翻訳後修飾は、ヒストンタンパク質から生成されたペプチド中の単一残基でも観察することができた。酪酸ナトリウムによるスフェロイドの処理は、ヒストンアセチル化の相対的存在量を増加させたが、コハク酸ナトリウムによるものは、スクシニル化を増強したヒストン残基を有する。この方法はまた、酪酸ナトリウム処理後のヒストンアセチル化の分布パターンと、コハク酸ナトリウムによる処理後のヒストンコハク酸化の分布パターンを実証した。
結果はまた、異なるヒストン修飾の一般的なパターンを示した。酪酸ナトリウム処理は、ヒストンタンパク質H3から生成されたペプチド上のリジン残基14のアセチル化を有意に増強したが、それは、その第9のリジン残基が2つのメチル基を有し、1つまたは3つのメチル基を有しなかった場合のみである。H3由来ペプチドにおける個々の修飾および翻訳後修飾の様々な組み合わせの相対的存在量も計算した。
酪酸ナトリウム処理後の翻訳後修飾の組合せパターンも、ヒストンタンパク質H4から生成されたペプチドにおいて観察された。ここでも、酪酸ナトリウム処理はアセチル化の有意な増加をもたらした。回転楕円体をできるだけベンチに置かないようにし、サンプルのこぼれを避けるために脱塩ステップで重要な注意を払う必要があります。このワークフローは、高速複製扁平細胞培養よりも生理学的モデルを使用して、固体組織中のクロマチンを探索するために使用することができる。
