La dinamica globale della cromatina ha dimostrato di essere un importante mediatore di diversi stati patologici, come il cancro e l'invecchiamento. Il nostro protocollo fornisce un modello fisiologicamente rilevante per studiare questo processo. L'analisi di laboratorio standard delle modifiche post-traduzionali degli istoni o PTMS è solitamente limitata al sondaggio per un singolo PTM alla volta utilizzando saggi basati su anticorpi.
L'analisi della spettrometria di massa per cromatografia liquida dell'istone PTMS ci consente di misurare l'abbondanza di centinaia di PTMS in un singolo esperimento. A dimostrare la procedura saranno Stephanie Stransky, Ronald Cutler e Julie Kim, rispettivamente postdoc, studente laureato e tecnico di ricerca del laboratorio. In primo luogo, utilizzando mezzi di crescita standard, far crescere le cellule come un monostrato fino a quando non sono confluenti all'80%.
Quindi lavare le cellule con HBSS. Aggiungere cinque millilitri di 0,05% tripsina-EDTA diluiti in HBSS. Incubare le cellule per cinque minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Utilizzare un microscopio per controllare il distacco delle cellule. Dopo aver contato le cellule, diluire la sospensione cellulare con mezzi di crescita freschi. Aggiungere 0,5 millilitri di mezzi di crescita per equilibrare una piastra inferiore rotonda a 24 pozzetti con più micro-pozzetti in ciascuno.
Quindi centrifugare le piastre a 3000 x g per rimuovere le bolle d'aria dalla superficie della piastra. Ora trasferire la sospensione cellulare precedentemente prodotta nella piastra a 24 pozzetti e centrifugare per tre minuti a 120 x g. Controllare le cellule nella piastra a 24 pozzetti e quindi incubare le piastre a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 24 ore per la formazione di sferoidi.
Nel frattempo, per equilibrare il bioreattore, aggiungere 25 millilitri di acqua sterile alla camera di umidità e nove millilitri di mezzi di crescita alla camera cellulare. Incubare il bioreattore in un incubatore clinostat rotante per 24 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Staccare gli sferoidi dalla piastra a 24 pozzetti con attacco ultra basso mediante pipettaggio delicato con punte di foro larghe un millilitro e trasferirle in un piatto di coltura tissutale.
Per selezionare sferoidi sufficientemente forme, controllare la qualità degli sferoidi al microscopio. Gli sferoidi di buona qualità hanno dimensioni, compattezza e rotondità uniformi. Riempire il bioreattore equilibrato con cinque millilitri di terreni di crescita freschi e trasferire gli sferoidi in esso.
Quindi riempire completamente il bioreattore con mezzi di crescita freschi e mettere il bioreattore nell'incubatore clinostat a 10-11 RPM. Ogni due o tre giorni, scambia i mezzi di crescita sostituendo 10 millilitri di vecchi media con nuovi media. Poiché questi sferoidi aumentano in dimensioni e numero, aumentare la velocità di rotazione dell'incubatore.
Dopo aver ottenuto il pellet sferoide, aggiungere cinque volumi di acido solforico molare freddo 0,2 al pellet e pipettare su e giù per interrompere il pellet e rilasciare istoni. Una volta ottenuto il surnatante dopo la centrifugazione, aggiungere acido tricloroacetico concentrato a freddo, in modo tale che la concentrazione finale diventi dal 25 al 30% volume per volume. E mescolalo invertendo il tubo un paio di volte e centrifuga come descritto nel manoscritto.
Dopo aver scartato il surnatante, utilizzando una pipetta di pascolo in vetro, lavare il pellet e le pareti del tubo con circa 500 microlitri di acetone freddo e acido cloridrico allo 0,1%, quindi centrifugare a 3.400 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi capovolgere il tubo per scartare il surnatante. Utilizzando una pipetta da pascolo in vetro, aggiungere 500 microlitri di acetone freddo al 100% per lavare il pellet e la centrifuga come dimostrato in precedenza.
Dopo aver scartato il surnatante, rimuovere completamente l'acetone pipettando con cura e lasciare asciugare il campione con un coperchio aperto per circa 20 minuti. Risospendare il pellet in 20 microlitri dal 15 al 20% di acetonitrile in un bicarbonato di ammonio da 100 millimolari di pH 8. Dopo il vortice, abbassare la sospensione a 1000 x g per 30 secondi.
Per otto o più campioni, trasferire ciascun campione sospeso su una piastra a 96 pozzetti. Quindi, in una cappa, aggiungere due microlitri di anidride propionica e mescolare pipettando cinque volte. Aggiungere rapidamente 10 microlitri di idrossido di ammonio e mescolare pipettando cinque volte.
Mescolare la resina HLB su una piastra magnetica. Quindi aggiungere 70 microlitri della sospensione HLB a ciascun pozzetto di una piastra filtrante a 96 pozzetti su una piastra di raccolta a 96 pozzetti. Dopo aver scartato il flusso, lavare la resina con 100 microlitri di acido trifluoroacetico allo 0,1%.
Dopo aver risospeso ogni campione in 100 microlitri di acido trifluoroacetico allo 0,1%, caricare ogni campione in ciascun pozzetto ed evitare schizzi usando un vuoto. Dopo aver scartato il flusso, lavare i campioni con 100 microlitri di acido trifluoroacetico allo 0,1% e posizionare la piastra filtrante su una nuova piastra di raccolta. Quindi, aggiungere 60 microlitri di acetonitrile al 60% in acido trifluoroacetico allo 0,1% a ciascun pozzetto e prevenire schizzi usando il vuoto.
Raccogliere il flusso attraverso e asciugare in un vuoto di velocità. Caricare la piastra di raccolta essiccata nell'HPLC ed eseguire il metodo LC/MS/MS come descritto nel manoscritto. In questo studio, la relativa abbondanza di modificazioni post-traduzionali degli istoni comuni è stata osservata negli epatociti C3A cresciuti come sferoidi tridimensionali.
Modifiche post-traduzionali potrebbero anche essere osservate su un singolo residuo in peptidi generati da proteine istoniche. Il trattamento degli sferoidi con butirrato di sodio ha aumentato l'abbondanza relativa di acetilazione degli istoni, mentre quello con il succinato di sodio ha migliorato la succinilazione dei residui di istoni. Il metodo ha anche dimostrato il modello di distribuzione dell'acetilazione degli istoni dopo il trattamento con butirrato di sodio e quello della succinilazione degli istoni dopo il trattamento con succinato di sodio.
Il risultato ha anche mostrato modelli commonatoriali di diverse modifiche istoniche. I trattamenti con butirrato di sodio hanno migliorato significativamente l'acetilazione del residuo di lisina 14 su un peptide generato dalla proteina istonica H3, solo quando il suo nono residuo di lisina aveva due gruppi metilici, ma non uno o tre gruppi metilici. Sono state calcolate anche le abbondanze relative di singole modificazioni e varie combinazioni di modifiche post-traduzionali nel peptide derivato da H3.
Modelli combinatori di modificazioni post-traduzionali dopo il trattamento con butirrato di sodio sono stati osservati anche in un peptide generato dalla proteina istone H4. Anche in questo caso, il trattamento con butirrato di sodio ha comportato un aumento significativo dell'acetilazione. L'attenzione critica dovrebbe essere posta sul mantenere gli sferoidi sul banco il meno possibile e in una fase di dissalazione per evitare la fuoriuscita del campione. Questo flusso di lavoro può essere utilizzato per esplorare la cromatina nei tessuti solidi utilizzando un modello più fisiologico rispetto alle colture cellulari piatte a replica rapida.
