La dynamique mondiale de la chromatine s’est avérée être un médiateur important de plusieurs états pathologiques, tels que le cancer et le vieillissement. Notre protocole fournit un modèle physiologiquement pertinent pour étudier ce processus. L’analyse de laboratoire standard des modifications post-traductionnelles des histones ou PTMS se limite généralement à sonder un seul PTM à la fois à l’aide de tests à base d’anticorps.
L’analyse par spectrométrie de masse par chromatographie liquide des HISMS nous permet de mesurer l’abondance de centaines de PTMS en une seule expérience. Stephanie Stransky, Ronald Cutler et Julie Kim, postdoctorante, étudiante diplômée et technicienne en recherche, respectivement, du laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Tout d’abord, en utilisant des milieux de croissance standard, cultivez les cellules sous forme de monocouche jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 80%.
Ensuite, lavez les cellules avec HBSS. Ajouter cinq millilitres de 0,05 % de trypsine-EDTA dilués dans hbss. Incuber les cellules pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Utilisez un microscope pour vérifier le détachement des cellules. Après avoir compté les cellules, diluer la suspension cellulaire avec un milieu de croissance frais. Ajouter 0,5 millilitre de milieu de croissance pour équilibrer une plaque de fond ronde à 24 puits à fixation ultra faible avec plusieurs micro-puits dans chacun.
Ensuite, centrifugez les plaques à 3000 x g pour éliminer les bulles d’air de la surface de la plaque. Maintenant, transférez la suspension de cellule précédemment fabriquée sur la plaque de 24 puits et centrifugez pendant trois minutes à 120 x g. Vérifiez les cellules dans la plaque de 24 puits, puis incubez les plaques à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures pour la formation de sphéroïdes.
Pendant ce temps, pour équilibrer le bioréacteur, ajoutez 25 millilitres d’eau stérile à la chambre d’humidité et neuf millilitres de milieu de croissance à la chambre cellulaire. Incuber le bioréacteur dans un incubateur à clinostat rotatif pendant 24 heures à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Détachez les sphéroïdes de la plaque à 24 puits à fixation ultra basse en pipetant doucement à l’aide d’embouts d’alésage d’un millilitre de large et transférez-les dans un plat de culture tissulaire.
Pour sélectionner suffisamment de formes de sphéroïdes, vérifiez la qualité des sphéroïdes au microscope. Les sphéroïdes de bonne qualité ont une taille, une compacité et une rondeur uniformes. Remplissez le bioréacteur équilibré avec cinq millilitres de milieux de croissance frais et transférez-y les sphéroïdes.
Ensuite, remplissez complètement le bioréacteur avec des milieux de croissance frais et placez le bioréacteur dans l’incubateur de clinostat à 10 à 11 tr / min. Tous les deux à trois jours, échangez des supports de croissance en remplaçant 10 millilitres d’anciens supports par des supports frais. Au fur et à mesure que ces sphéroïdes augmentent en taille et en nombre, augmentez la vitesse de rotation de l’incubateur.
Après avoir obtenu la pastille sphéroïde, ajoutez cinq volumes d’acide sulfurique molaire 0,2 froid à la pastille et pipetez de haut en bas pour perturber la pastille et libérer des histones. Une fois le surnageant obtenu après centrifugation, ajouter de l’acide trichloroacétique concentré à froid, de sorte que la concentration finale atteigne 25 à 30% vol par volume. Et mélangez-le en inversant le tube plusieurs fois et en centrifugeant comme décrit dans le manuscrit.
Après avoir jeté le surnageant, à l’aide d’une pipette de pâturage en verre, lavez la pastille et les parois du tube avec environ 500 microlitres d’acétone froide et 0,1% d’acide chlorhydrique, puis centrifugez à 3 400 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retournez ensuite le tube pour jeter le surnageant. À l’aide d’une pipette de pâturage en verre, ajoutez 500 microlitres d’acétone 100% froide pour laver la pastille et centrifuger comme démontré précédemment.
Après avoir jeté le surnageant, retirez complètement l’acétone en pipetant soigneusement et laissez l’échantillon sécher avec un couvercle ouvert pendant environ 20 minutes. Remettre en suspension la pastille dans 20 microlitres de 15 à 20% d’acétonitrile dans un bicarbonate d’ammonium de 100 millimolaires de pH 8. Après le vortex, faites tourner la suspension à 1000 x g pendant 30 secondes.
Pour huit échantillons ou plus, transférer chaque échantillon en suspension dans une plaque de 96 puits. Ensuite, dans une hotte, ajoutez deux microlitres d’anhydride propionique et mélangez en pipetant cinq fois. Ajouter rapidement 10 microlitres d’hydroxyde d’ammonium et mélanger en pipetant cinq fois.
Mélanger la résine HLB sur une plaque magnétique. Ajoutez ensuite 70 microlitres de suspension HLB à chaque puits d’une plaque filtrante de 96 puits sur une plaque de collecte de 96 puits. Après avoir jeté l’écoulement, lavez la résine avec 100 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,1%.
Après avoir remis chaque échantillon en suspension dans 100 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,1 %, chargez chaque échantillon dans chaque puits et évitez les éclaboussures à l’aide d’un vide. Après avoir éliminé le flux, lavez les échantillons avec 100 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,1% et placez la plaque filtrante sur une nouvelle plaque de collecte. Ensuite, ajoutez 60 microlitres de 60% d’acétonitrile dans 0,1% d’acide trifluoroacétique à chaque puits et évitez les éclaboussures sous vide.
Collectez le flux à travers et séchez dans un vide rapide. Chargez la plaque de collecte séchée dans la CLHP et exécutez la méthode LC/MS/MS comme décrit dans le manuscrit. Dans cette étude, l’abondance relative des modifications post-traductionnelles courantes des histones a été observée dans les hépatocytes C3A cultivés sous forme de sphéroïdes tridimensionnels.
Des modifications post-traductionnelles ont également pu être observées sur un seul résidu dans les peptides générés à partir de protéines d’histones. Le traitement des sphéroïdes avec du butyrate de sodium a augmenté l’abondance relative de l’acétylation des histones, tandis que celui avec le succinate de sodium a amélioré la succinylation des résidus d’histones. La méthode a également démontré le schéma de distribution de l’acétylation des histones après un traitement au butyrate de sodium et celui de la succinylation des histones après un traitement au succinate de sodium.
Le résultat a également montré des modèles communs de différentes modifications des histones. Les traitements au butyrate de sodium ont significativement amélioré l’acétylation du résidu de lysine 14 sur un peptide généré à partir de la protéine d’histone H3, seulement lorsque son neuvième résidu de lysine avait deux groupes méthyle, mais pas un ou trois groupes méthyle. Les abondances relatives de modifications individuelles et de diverses combinaisons de modifications post-traductionnelles dans le peptide dérivé de H3 ont également été calculées.
Des schémas combinatoires de modifications post-traductionnelles après un traitement au butyrate de sodium ont également été observés dans un peptide généré à partir de la protéine d’histone H4. Ici aussi, le traitement au butyrate de sodium a entraîné une augmentation significative de l’acétylation. Une attention critique doit être accordée au maintien des sphéroïdes sur le banc le moins possible et dans une étape de dessalement pour éviter le déversement des échantillons. Ce flux de travail peut être utilisé pour explorer la chromatine dans les tissus solides en utilisant un modèle plus physiologique que les cultures cellulaires plates à réplication rapide.
