Küresel kromatin dinamiklerinin, kanser ve yaşlanma gibi çeşitli hastalık durumlarının önemli bir aracısı olduğu gösterilmiştir. Protokolümüz bu süreci incelemek için fizyolojik olarak ilgili bir model sağlar. Histon post-translasyonel modifikasyonların veya PTMS'nin standart laboratuvar analizi genellikle antikor bazlı tahliller kullanılarak bir seferde tek bir PTM için problama ile sınırlıdır.
Histon PTMS'nin sıvı kromatografisi kütle spektrometrisi analizi, yüzlerce PTMS'nin bolluğunu tek bir deneyde ölçmemizi sağlar. Prosedürü gösterenler, sırasıyla laboratuvardan Stephanie Stransky, Ronald Cutler ve doktora sonrası, yüksek lisans öğrencisi ve araştırma teknolojisi olan Julie Kim olacak. İlk olarak, standart büyüme ortamını kullanarak, hücreleri% 80 birleşene kadar tek katmanlı olarak büyütün.
Sonra hücreleri HBSS ile yıkayın. HBSS'de seyreltilmiş beş mililitre% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. Hücreleri% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede beş dakika boyunca inkübe edin.
Hücre ayrılmasını kontrol etmek için mikroskop kullanın. Hücreleri saydıktan sonra, hücre süspansiyonunu taze büyüme ortamı ile seyreltin. Her birinde birden fazla mikro kuyucuk bulunan ultra düşük ataşmanlı 24 delikli yuvarlak alt plakayı dengelemek için 0,5 mililitre büyüme ortamı ekleyin.
Daha sonra, plakanın yüzeyindeki hava kabarcıklarını gidermek için plakaları 3000 x g'de santrifüj edin. Şimdi daha önce yapılmış hücre süspansiyonunu 24 delikli plakaya aktarın ve 120 x g'de üç dakika boyunca santrifüj yapın. 24 delikli plakadaki hücreleri kontrol edin ve ardından küresel oluşum için plakaları 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.
Bu arada, biyoreaktörü dengelemek için, nem odasına 25 mililitre steril su ve hücre odasına dokuz mililitre büyüme ortamı ekleyin. Biyoreaktörü, dönen bir klinostat inkübatöründe 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir mililitre genişliğinde delik uçları kullanarak hafifçe pipetleyerek sferoidleri ultra düşük ataşmanlı 24 delikli plakadan ayırın ve bir doku kültürü kabına aktarın.
Yeterli form sferoidlerini seçmek için, mikroskop altında sferoidlerin kalitesini kontrol edin. Kaliteli sferoidler tek tip boyuta, kompaktlığa ve yuvarlaklığa sahiptir. Dengeli biyoreaktörü beş mililitre taze büyüme ortamı ile doldurun ve sferoidleri içine aktarın.
Daha sonra biyoreaktörü tamamen taze büyüme ortamı ile doldurun ve biyoreaktörü klinostat inkübatörüne 10 ila 11 RPM'de yerleştirin. Her iki ila üç günde bir, 10 mililitre eski medyayı taze medyayla değiştirerek büyüme ortamını değiştirin. Bu sferoidlerin büyüklüğü ve sayısı arttıkça, inkübatörün dönme hızını arttırın.
Küresel peleti elde ettikten sonra, peleti bozmak ve histonları serbest bırakmak için pelet ve pipete beş hacim soğuk 0.2 molar sülfürik asit ekleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatant elde edildikten sonra, soğuk konsantre trikloroasetik asit ekleyin, böylece nihai konsantrasyon hacimce% 25 ila% 30 hacim haline gelir. Ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın ve el yazmasında açıklandığı gibi santrifüj yapın.
Süper natantı attıktan sonra, bir cam mera pipeti kullanarak, peleti ve tüpün duvarlarını yaklaşık 500 mikrolitre soğuk aseton ve% 0.1 hidroklorik asit ile yıkayın ve ardından dört santigrat derecede beş dakika boyunca 3.400 x g'de santrifüj yapın. Sonra süpernatanı atmak için tüpü çevirin. Bir cam mera pipeti kullanarak, daha önce gösterildiği gibi pelet ve santrifüjü yıkamak için 500 mikrolitre% 100 soğuk aseton ekleyin.
Süpernatanı attıktan sonra, dikkatlice pipetleyerek, asetonunu tamamen çıkarın ve numunenin açık bir kapakla yaklaşık 20 dakika kurumasını bekleyin. Pelet, pH 8'in 100 milimolar amonyum bikarbonatında 20 mikrolitrelik 15 ila% 20 asetonitril içinde yeniden askıya alın. Girdaptan sonra, süspansiyonu 30 saniye boyunca 1000 x g'de döndürün.
Sekiz veya daha fazla numune için, her bir askıya alınmış numuneyi 96 delikli bir plakaya aktarın. Daha sonra, bir davlumbazda, iki mikrolitre propiyonik anhidrit ekleyin ve beş kez pipetleyerek karıştırın. Hızlı bir şekilde 10 mikrolitre amonyum hidroksit ekleyin ve beş kez pipetleyerek karıştırın.
HLB reçinesini manyetik bir karıştırma plakası üzerinde karıştırın. Ardından, 96 delikli bir toplama plakası üzerindeki 96 delikli bir filtre plakasının her bir kuyucuğuna 70 mikrolitre HLB süspansiyonu ekleyin. Akışı attıktan sonra, reçineyi 100 mikrolitre% 0.1 trifloroasetik asit ile yıkayın.
Her numuneyi 100 mikrolitre% 0.1 trifloroasetik asit içinde yeniden askıya aldıktan sonra, her bir numuneyi her bir kuyucuğa yükleyin ve bir vakum kullanarak sıçramayı önleyin. Akışı attıktan sonra, numuneleri 100 mikrolitre% 0.1 trifloroasetik asit ile yıkayın ve filtre plakasını yeni bir toplama plakasına koyun. Daha sonra, her bir oyuğa% 0.1 trifloroasetik asit içinde 60 mikrolitre% 60 asetonitril ekleyin ve vakum kullanarak sıçramayı önleyin.
Akışı toplayın ve hızlı bir vakumda kurutun. Kurutulmuş toplama plakasını HPLC'ye yükleyin ve makalede açıklandığı gibi LC/MS/MS yöntemini çalıştırın. Bu çalışmada, üç boyutlu sferoidler olarak yetiştirilen C3A hepatositlerinde ortak histon post-translasyonel modifikasyonların göreceli bolluğu gözlenmiştir.
Post-translasyonel modifikasyonlar, histon proteinlerinden üretilen peptitlerdeki tek bir kalıntı üzerinde de gözlemlenebilir. Sferoidlerin sodyum bütirat ile tedavisi, histon asetilasyonunun göreceli bolluğunu arttırırken, sodyum süksinat ile histon kalıntısı süksinasyonunu arttırdı. Yöntem ayrıca sodyum bütirat tedavisinden sonra histon asetilasyonunun ve sodyum süksinat ile tedaviden sonra histon süksinilasyonun dağılım paternini göstermiştir.
Sonuç ayrıca farklı histon modifikasyonlarının ortak paternlerini de gösterdi. Sodyum bütirat tedavileri, lizin kalıntısı 14'ün histon proteini H3'ten üretilen bir peptit üzerindeki asetilasyonunu önemli ölçüde arttırdı, ancak dokuzuncu lizin kalıntısı iki metil grubuna sahip olduğunda, ancak bir veya üç metil grubuna sahip olmadığında. H3 türevi peptiddeki bireysel modifikasyonların ve çeşitli post-translasyonel modifikasyonların kombinasyonlarının göreceli bollukları da hesaplandı.
Sodyum bütirat tedavisinden sonra translasyonel modifikasyonların kombinatoryal paternleri, histon proteini H4'ten üretilen bir peptidde de gözlenmiştir. Burada da, sodyum bütirat tedavisi asetilasyonda önemli bir artışa neden olmuştur. Numune dökülmesini önlemek için sferoidlerin tezgahta mümkün olduğunca az tutulmasına ve tuzdan arındırma adımına dikkat edilmelidir. Bu iş akışı, hızlı çoğalan düz hücre kültürlerinden daha fizyolojik bir model kullanarak katı dokulardaki kromatini keşfetmek için kullanılabilir.
