Este protocolo permite el aislamiento de compuestos de moluscos con propiedades anticriptocócicas. Esta técnica ofrece un enfoque imparcial para identificar y aislar compuestos de moluscos con propiedades potenciales, incluida la eliminación de patógenos fúngicos humanos. Hay otros compuestos, como los inhibidores de la proteasa del VIH, que se utilizan para tratar a los pacientes con VIH.
Sin embargo, la expansión a otros patógenos, así como la investigación de fuentes naturales, representa nuevas vías de descubrimiento. El último paso es el más difícil ya que las muestras pueden no filtrarse. Como resultado, es posible que sea necesario diluir las muestras para filtrar.
Comience recolectando moluscos como Cipangopaludina chinensis de un área natural designada y aprobada. Seleccione especies nativas e invasoras para evaluar una amplia gama de posibles efectos antifúngicos. Rompa suavemente la cáscara de la C.chinensis con un mortero y retire las piezas sólidas con un par de pinzas.
Generalmente, 10 moluscos se agrupan para el protocolo. Recoja y pese aproximadamente de 15 a 20 gramos de la muestra y use tijeras para cortar los órganos en trozos pequeños de aproximadamente 0.5 a un centímetro de tamaño. Congele rápidamente las muestras de órganos diseccionadas y cortadas con nitrógeno líquido antes de moler las muestras de órganos en un polvo fino con un mortero.
Una vez hecho esto, agregue aproximadamente 15 gramos del polvo de muestra de órgano a 30 mililitros de agua destilada fría para lograr una proporción de uno a dos. Vierta dos mililitros de la muestra en tubos de dos mililitros de alto impacto y agregue aproximadamente 500 microgramos de perlas de acero inoxidable de tres milímetros a cada tubo. Homogeneice durante tres minutos a 1, 200 RPM en cuatro grados centígrados usando una licuadora de balas o un batidor de cuentas.
Centrifugar el tubo a 12, 000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante en un tubo fresco de 50 mililitros y deseche el pellet. Esterilice el sobrenadante con filtro con una membrana de 0,22 micrómetros y almacene las muestras en hielo antes de aclarar el extracto.
Coloque la muestra sobrenadante en un baño térmico a 60 grados centígrados durante 30 minutos e inmediatamente enfríela transfiriendo la muestra a un cubo lleno de hielo durante 20 minutos. Centrifugar las muestras frías a 15, 000 G durante 45 minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante en un tubo fresco de 50 mililitros y deseche el pellet.
Esterilice las muestras con un filtro de membrana de 0,22 micras y luego guárdelas en hielo. Una vez hecho esto, determine la concentración de proteína en el crudo y los extractos clarificados utilizando un ensayo de cuantificación. El rango óptimo de concentración de proteínas es de cuatro a ocho microgramos por mililitro.
Incubar las muestras en hielo durante un máximo de una hora o congelar rápidamente en nitrógeno líquido antes de almacenarlas a menos 20 grados centígrados hasta que sea necesario. En una placa de fondo plano de 96 pocillos, incubar 10 microlitros de cuatro miligramos por mililitro de extracto de proteína de molusco crudo o clarificado, 10 microlitros de subtilisina A, con una concentración dentro del rango lineal medido, y 220 microlitros de clorhidrato de tris 100 milimolares de pH de 8.6 durante 10 minutos a 25 grados centígrados. Luego agregue 10 microlitros de N-succinil-alanina, alanina, prolina, fenolalanina, p-nitroanilina, el sustrato para subtilisina A, a una concentración final de un KM para un volumen de reacción final de 250 microlitros.
Una vez hecho esto, mida la actividad enzimática monitoreando la densidad óptica a 405 nanómetros cada 15 segundos durante tres minutos. Asegúrese de que los pocillos sin extractos produzcan una curva recta durante la lectura. Para determinar la actividad enzimática residual, calcule la relación entre la actividad enzimática en presencia de extracto de molusco y la que existe en ausencia del extracto.
Si se observa actividad inhibitoria, medir el valor de concentración inhibitoria 50 o IC50 utilizando un rango de concentraciones de los extractos. Introducir una sola colonia de C.neoformans H99 tipo salvaje en cinco mililitros de extracto de levadura peptona dextrosa o medio YEPD utilizando una punta de pipeta de 10 microlitros e incubar durante 16 a 18 horas a 30 grados centígrados y 200 RPM. Recolectar 500 microlitros del cultivo en una cubeta y medir el crecimiento leyendo la densidad óptica a 600 nanómetros.
Diluir el cultivo con levadura base de nitrógeno o medio YNB a una densidad óptica final de 0,02. Cocultivo de células de C.neoformans con diferentes concentraciones de extractos crudos y clarificados mezclando 10 microlitros de los extractos con 190 microlitros del cultivo diluido de C.neoformans en una placa de 96 pocillos. Mida el crecimiento leyendo la densidad óptica a 600 nanómetros usando un lector de placas cada 15 minutos a una hora durante 72 horas a 200 RPM y 37 grados centígrados.
Los extractos de C.chinensis fueron capaces de inhibir la actividad proteolítica de la subtilisina A, que está relacionada con la virulencia en Cryptococcus neoformans con un valor IC50 de 5,3 microgramos por mililitro en extractos crudos y 4,53 microgramos por mililitro en extractos clarificados. La evaluación de los extractos de C.chinensis contra los procesos asociados con la producción del factor de virulencia de C.Neoformens, incluido el crecimiento fúngico, mostró que hubo una reducción significativa en el crecimiento de hongos a 37 grados centígrados en presencia de los extractos crudos y clarificados de C.chinensis. La evaluación de los extractos contra la cápsula, la producción de melanina y la formación de biopelículas mostró que no hubo cambios en la producción de cápsulas o melanina en presencia de extractos crudos o clarificados de C. chinensis.
Sin embargo, se observó una reducción significativa del 70 al 80% en la formación de biopelículas a altas concentraciones de extractos crudos y clarificados en relación con el control no tratado. El éxito del protocolo depende del procedimiento de extracción adecuado, incluida la molienda, la adición de la cantidad adecuada de enzima y la lectura después de la adición del sustrato. La técnica se centra en la tolerancia térmica como un importante factor de virulencia criptocócica.
Sin embargo, se pueden evaluar otros factores de virulencia como la producción de melanina y cápsulas, así como la formación de biopelículas. Estos resultados abren nuevas vías que constituyen nuevos enfoques sobre estrategias antifúngicas utilizando compuestos naturales que ofrecen más estabilidad, especificidad y son menos propensos a la resistencia. El objetivo a largo plazo es encontrar nuevos métodos contra estos patógenos fúngicos y minimizar los mecanismos de resistencia.
