Las propiedades biomecánicas de las células y tejidos regulan su función y vitalidad. AFM permite la cuantificación temprana de la osteoartritis a nivel celular basada en mediciones de elasticidad. AFM permite la adquisición de mediciones a nivel celular sin dañar la muestra y con una alta resolución, fiabilidad y sensibilidad.
Los cambios biomecánicos de la propiedad ocurren temprano en la osteoartritis. La medición de la elasticidad local del cartílago articular permite extraer conclusiones válidas sobre el grado de degeneración del tejido local. Para evaluar los cambios degenerativos dentro de la articulación de la rodilla humana, primero utilice un bisturí para cortar el cartílago articular como un todo del hueso subcondral e incrustar la muestra de cartílago en medio de incrustación soluble en agua en la perilla De Cryotome que se congela a baja temperatura en el dispositivo Cryotome.
Cuando la muestra se haya congelado, utilice un Cryotome estándar para adquirir secciones de tejido de 35 micrómetros de espesor de la capa superior del cartílago articular, recogiendo cada sección en diapositivas de vidrio individuales. Una vez obtenidas todas las secciones, enjuague las muestras tres veces en PBS fresco durante cinco minutos por lavado para retirar el medio de incrustación soluble en agua. Retire la primera diapositiva del lavado.
Después de esto, agregue dos o tres gotas de pegamento de muestra biocompatible por sección en platos Petri individuales compatibles con AFM. Retire cualquier exceso de solución de la muestra y presione suavemente los bordes de la sección seca sobre las manchas de pegamento. Después de dos minutos, cubra cuidadosamente los tejidos unidos con el medio L-15 de Leibovitz sin L-glutamina y coloque los platos en una incubadora de cultivo celular hasta que se analicen las muestras.
Para preparar el dispositivo AFM, ajuste un bloque de gas para medir en un entorno líquido en el soporte AFM a que la superficie superior sea paralela al soporte, y utilice pinzas para montar cuidadosamente el voladizo seleccionado en la superficie del bloque de vidrio de modo que la punta AFM con la microesfera sobresalga sobre el plano óptico pulido. Para estabilizar el voladizo en el bloque de vidrio, deslice el resorte metálico en la ranura del bloque y utilice pinzas para sujetar la parte superior del voladizo con el resorte. Coloque cuidadosamente el bloque de vidrio con el voladizo en el cabezal AFM y fije el bloque con el mecanismo de bloqueo integrado.
A continuación, monte el cabezal AFM con el voladizo en el dispositivo AFM con el resorte orientado hacia la izquierda. Para montar la muestra en el dispositivo AFM, coloque la muestra de placa Petri en el portacuchillas AFM y ajuste el calentador de platos Petri a 37 grados Centígrados. Después de unos 20 minutos, abra el software del dispositivo y las ventanas de configuración de parámetros de aproximación y alineación láser.
A continuación, encienda el motor paso a paso, la luz láser y la cámara CCD y utilice la función de motor paso a paso para bajar el voladizo en pasos de 100 micrómetros hasta que el voladizo esté completamente sumergido en el medio. Utilice los tornillos de ajuste para dirigir el láser en la parte superior del voladizo y utilice los tornillos del dispositivo AFM para ajustar el rayo láser de modo que el haz reflejado caiga en el centro del fotodetector. Una vez ajustado el voladizo láser, ajuste el fotodetector según sea necesario para ajustar la señal de suma a un voltio o superior y las desviaciones laterales y verticales a cerca de cero.
Para obtener la curva de fuerza de calibración, ejecute un enfoque de escáner con los parámetros de aproximación indicados en la tabla. Una vez que se alcance la parte inferior de la planta de cultivo de tejido, retraiga el voladizo en 100 micrómetros. Configure los parámetros de ejecución como se indica en la tabla.
Y haga clic en ejecutar para iniciar una medición y obtener una curva de distancia de fuerza de calibración. La curva de fuerza se obtiene como se ilustra en la figura. En la curva de distancia de fuerza de calibración, seleccione la región para un ajuste lineal de la curva retraída.
Una vez que el ajuste lineal está en su lugar, los valores serán guardados por el software. A continuación, a medida que las mediciones se realizan en medio a 37 grados Celsius temperatura, establezca la variable de temperatura en el software en 37 grados para imitar las condiciones fisiológicas lo más estrechamente posible. Para identificar los patrones de conversita en las secciones de la muestra de cartílago, localice e identifique los patrones celulares específicos del cartílago articular a partir de la rodilla osteoartrítica en el microscopio de contraste de fase, que pueden incluir cadenas simples indicativas de áreas de tejido sano, doble cadena indicativa del comienzo de la degeneración tisular, pequeños racimos, que son signos de degeneración avanzada del tejido, y grandes racimos, indicativos de la destrucción del tejido final.
Una vez que se ha identificado un patrón deseado específico, para mediciones de matriz pericelular, coloque el voladizo cerca de las celdas y mida dos sitios por patrón elegido por tipo de matriz, nueve veces por sitio de medición, incluyendo un tamaño de muestra lo suficientemente grande como para tener en cuenta posibles inexactitudes. Concéntrese en la matriz celular del patrón a medir y fije el ratón de la computadora en ese punto. A continuación, concéntrese en la sonda y mueva la punta de la sonda al punto previamente fijado por la flecha del equipo.
Para realizar mediciones de la matriz extracelular, seleccione una región sin células y realice un enfoque seguido de una retracción para que el voladizo se coloque 100 micrómetros por encima del tejido. A continuación, haga clic en Ejecutar para iniciar las mediciones, utilizando el parámetro de consigna obtenido mediante la calibración del voladizo. Para procesar los datos obtenidos, abra el software de procesamiento de datos compatible con los datos obtenidos del dispositivo AFM y seleccione el modelo Hearst en el software para procesar las curvas de distancia de fuerza.
Establezca la relación de Poisson en 0,5, la forma de la punta como esférica y el radio de la punta en 12,5 micrómetros. Una vez ajustados todos los parámetros, se ajustarán los resultados y el programa de Young's Modulus será calculado por el software. A lo largo del modelo fisiopatológico de cuerdas a cadenas dobles y de racimos pequeños a grandes, los módulos elásticos de matriz extracelular y pericelular disminuyen significativamente entre cada cambio de patrón, excepto entre cadenas y cadenas dobles.
Además, la relación de matriz extracelular-pericelular no cambia significativamente, mientras que se observa una marcada disminución en las diferencias absolutas de elasticidad entre las matrices extracelulares y pericelulares. Los valores de elasticidad dependen de varias condiciones, como la profundidad de sangría o las propiedades de punta en voladizo. Por lo tanto, AFM es el más adecuado para comparar diferentes condiciones dentro de la misma configuración experimental.
Como el AFM mide la elasticidad local de la muestra, las secciones deben fijarse en su lugar para permitir mediciones precisas y evitar daños en voladizo. Para analizar más a fondo los procesos responsables de los cambios de elasticidad tisular, la cuantificación bioquímica de la estructura de las proteínas de interés se puede realizar a través de manchas occidentales o ELISAs.
