Actualmente tenemos una comprensión limitada de la biología de la infección hepática por plasmodium. Este protocolo nos ha ayudado a generar una gran cantidad de líneas transgénicas que han ayudado a responder algunas preguntas críticas sobre la biología del organismo. Se requiere una comprensión fundamental del parásito y su biología para desarrollar nuevas herramientas y enfoques para combatir la infección de la malaria.
El método de transgénesis que estamos describiendo aquí nos ha ayudado a descifrar algunas claves y complejas de la biología del organismo, así como del huésped. Carson Bowers, mi gerente de laboratorio, demostrará este procedimiento. Después de generar ratones infectados con P. Bergehei y sacrificarlos, recoja dos mililitros de sangre de dos ratones infectados en cinco mililitros de solución Elsevier en un ambiente estéril.
Centrifugar la sangre a 450 G durante ocho minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo de la célula en 10 mililitros de medio RPMI completo. Vuelva a centrifugar la suspensión celular y vuelva a suspender el gránulo en 25 mililitros de medio RPMI completo.
Transfiera la suspensión celular a un matraz de cultivo T75 con una tapa de filtro e incube agitando suavemente para mantener las células en suspensión. Al final de la incubación, recoja 500 microlitros de la muestra. Centrifugar y volver a suspender el pellet en 10 microlitros de medios RPMI completos.
A continuación, prepare un frotis de sangre fino. Tiñe el frotis de sangre con tinción de Giemsa y determina la frecuencia de esquizontes. Para una eficiencia óptima de la transfección, entre el 60 y el 70% de los parásitos deben estar en la etapa de esquizonte.
Prepare un tampón de centrifugación en gradiente reconstituyendo 13 mililitros de medio madre de gradiente de densidad en un tubo de centrifugación de 50 mililitros. Transfiera 25 mililitros de hemocultivo a un tubo de centrifugación nuevo de 50 mililitros. A continuación, coloque con cuidado 20 mililitros de tampón de centrifugación de gradiente en el fondo del tubo de centrifugación, utilizando una pipeta de vidrio estrecha para crear una columna de gradiente y garantizar una división clara entre el tampón y el medio.
Centrifugar el tampón y el medio preparados durante 20 minutos a 450 g sin descanso a temperatura ambiente. Con una pipeta de pastura, retire con cuidado la capa de esquizonte en la interfaz del medio de cultivo y el tampón de centrifugación de gradiente. Colóquelo en un nuevo tubo de centrifugación de 50 mililitros.
Vuelva a suspender los esquizontes aislados en medios RPMI completos y aumente el volumen total a 40 mililitros. Después de centrifugar y desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el esquizonte en 10 mililitros de medio RPMI completo. A continuación, transfiera un mililitro de esta solución a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para cada transfección y granule las células infectadas por centrifugación a 16.000 G durante cinco segundos.
A continuación, combine 100 microlitros del tampón de electroporación a temperatura ambiente con cinco microgramos de ADN plasmídico objetivo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Después de centrifugar las células infectadas, retire el sobrenadante y vuelva a suspender cuidadosamente las células en la solución nucleoefector preparada más ADN plasmídico. A continuación, transfiera la suspensión a la electroporación, las cubetas y transfecte utilizando un programa nucleofector adecuado.
A continuación, agregue 100 microlitros de medios RPMI completos a la cubeta. Transfiera toda la solución a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y colóquelo en hielo. Verificar diariamente los niveles de parasitemia en los ratones inoculados con el esquizonte transfectado a partir de los dos días posteriores a la inoculación.
Una vez confirmada la infección, se debe iniciar la selección del fármaco administrándolo por vía oral y bebiendo agua ofrecida ad libitum. Controlar la parasitemia mediante frotis de sangre a partir de los seis días posteriores al inicio del tratamiento con pirometimina. Cuando la parasitemia alcanza al menos el 1%, transfiera los parásitos a ratones B6 ingenuos para crear reservas de parásitos en etapa sanguínea.
Una vez que la parasitemia alcanza entre el 2% y el 5%, genere existencias y criopreservalas. Un día antes de la infección por mosquitos, separe los mosquitos hembra colocando un guante lleno de agua calentada a 37 grados centígrados encima de la jaula que contiene mosquitos machos y hembras. Use un aspirador de insectos para eliminar los mosquitos hembra atraídos por la fuente de calor y transfiéralos a una jaula más pequeña para la infección.
El día de la alimentación y la infección del mosquito, determine la parasitemia en los ratones B6 infectados. La parasitemia entre el 2% y el 5% es óptima para la infección por mosquitos. Después de verificar la parasitemia, transfiera la infección a los mosquitos hembra colocando los ratones anestesiados sobre los mosquitos hembra enjaulados en decúbito esternal.
Separe manualmente las patas delanteras y traseras para proporcionar la mayor superficie para la alimentación de los mosquitos. Deje a los ratones infectados en cada jaula durante 15 minutos, revisando cada cinco minutos para asegurarse de que los ratones no estén despiertos. Una vez que se complete la alimentación y se eutanasia a los ratones, deséchelos de manera segura siguiendo las pautas de la institución.
Para verificar el éxito de la infección dentro de los mosquitos, aísle el intestino medio de los mosquitos extirpando el segmento abdominal terminal con fórceps 10 días después de la infección. A continuación, observe el intestino medio bajo luz polarizada para detectar la presencia de ooquistes. A los 18 días después de la infección, diseccione de cinco a 10 mosquitos para evaluar el número de esporozoítos presentes.
Para aislar y contar los esporozoítos, retire con cuidado la cabeza del mosquito mientras aplica presión en el tórax con fórceps o una aguja fina de disección. Las glándulas salivales permanecerán adheridas a la cabeza extirpada. A continuación, retire cualquier resto de mosquitos adicional de las glándulas salivales y colóquelos en un tubo de microcentrífuga que contenga 400 microlitros de medios de disección de mosquitos.
Luego, interrumpa las glándulas salivales aisladas pasándolas a través de una jeringa de aguja de calibre 30 de 15 a 20 veces, Después, coloque 10 microlitros de las glándulas salivales interrumpidas en medios de disección de mosquitos en un hemocitómetro y cuente. Por último, vuelva a suspender las glándulas salivales en la concentración deseada de medios de disección de mosquitos o PBS para inyectarlas en ratones o criopreservación a largo plazo. Al igual que las microscopías, se presentan imágenes que representan el Schizont de P. berghei maduro e inmaduro en hemocultivos de ratón parasitados.
Al igual que las imágenes de microscopía de una cabeza de mosquito con las glándulas salivales aún intactas durante la disección, y la glándula salival disecada bajo aumentos más bajos y más altos. La generación de una señal de fluorescencia verde en las células huésped PB, GFP 11 infectadas con HEPA GFP de una a 10 indicó la lisis de la vacuola parasitófora. Es importante quitar con cuidado la capa de chaisson sin interrumpir la interfaz de degradado.
Además, se necesita un poco de práctica para eliminar de manera confiable las glándulas salivales junto con la cabeza durante el aislamiento ligero de las esporas. Tras el aislamiento, los esporozoítos transgénicos pueden crioconservarse o utilizarse frescos para estudios de infección in vivo o in vitro.
