La OCT es un agente de criopreservación incompatible con el análisis por espectrometría de masas. Usando este protocolo, los investigadores pueden eliminar la OCT de los tejidos y cuantificar los esfingolípidos con espectrometría de masas de cromatografía líquida en tándem. La preparación de mechas de secado de tejidos, lavado de tejidos y pesaje de tejidos será demostrada por April Boyd de Virginia Commonwealth University, y la extracción de lípidos será demostrada por el Dr. Jeremy Allegood, director de Virginia Commonwealth Metabolomics and Lipidomics Core.
Para comenzar, limpie las tijeras quirúrgicas sumergiéndolas en metanol durante cinco minutos, seguido de limpiarlas con un pañuelo limpio de laboratorio. Usando guantes sin polvo, gire el extremo de un tejido de grado de laboratorio para crear una mecha finamente cónica de 30 a 40 milímetros de largo. Luego, usando las tijeras limpias de metanol, corte la mecha en el extremo grueso y colóquela en una caja de cartón limpia.
Luego, usando las tijeras limpias con metanol, corte de cuatro a cinco milímetros de la punta de una punta de pipeta de un mililitro y vuelva a colocar la punta en el soporte de la punta. Para lavar la OCT de los tejidos, agregue 10 mililitros de agua desionizada ultrapura helada a cada tubo que contenga tejido pulmonar humano y cúbralos herméticamente. Deje que los tubos se incuben durante 10 minutos.
Vórtice vigorosamente cada tubo hasta que todo el tejido depositado en las paredes del tubo o el gránulo de tejido esté completamente resuspendido. Luego centrifugar los tubos en una centrífuga de cubo oscilante preenfriada a 4, 000 a 5, 000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Una vez completada la centrifugación, destape los tubos en hielo.
Aspire cuidadosamente la solución de lavado, dejando aproximadamente 0,5 mililitros del sobrenadante en el tubo, luego vuelva a tapar el tubo. Después de retirar el sobrenadante de todos los tubos, lave los pañuelos dos veces más de la misma manera. Después de los tres lavados de extracción de OCT, use la punta de pipeta acortada preparada para agregar 500 microlitros de PBS helado al tubo.
Usando la misma punta, resuspenda suavemente el pellet y transfiera todo el tejido resuspendido a un tubo centrífugo de 1,5 mililitros preetiquetado y pesado. Mantenga el tubo en hielo hasta que se transfieran todas las muestras de tejido. Granular los tejidos centrifugando los tubos en una centrífuga preenfriada, luego aspirar cuidadosamente la mayor cantidad posible de PBS sin alterar el pellet y volver a colocar los tubos en hielo.
Usando las mechas de secado de pañuelos preparadas anteriormente, retire suavemente cualquier solución de lavado restante, luego cierre el tubo y colóquelo en hielo. Para pesar los tubos, coloque un tubo a la vez en una balanza analítica tarada y puesta a cero recientemente calibrada y cierre la puerta de la cámara. Una vez que el peso se haya estabilizado, regístrelo en una hoja de cálculo electrónica.
Después de pesar, vuelva a colocar el tubo sobre hielo y agregue 300 microlitros de PBS helado. Con una punta de pipeta acortada, transfiera cuidadosamente todo el tejido a dos mililitros de metanol helado en un tubo de vidrio tapón de rosca preetiquetado. Antes de la extracción de lípidos, permita que los tejidos y los patrones de lípidos internos de espectrometría de masas se equilibren a temperatura ambiente durante 20 minutos, luego vórtice y sumerja las soluciones estándar internas en un baño de agua ultrasónico hasta que los estándares de lípidos se hayan disuelto por completo.
Con una pipeta de repetición, agregue 250 picomoles de los estándares internos de espectrometría de masas a cada tubo y vuelva a tapar ligeramente los tubos. Para facilitar la homogeneización, ajuste el volumen de metanol a dos mililitros, luego triture el tejido con un homogeneizador moviendo la punta del homogeneizador en un movimiento circular presionado suavemente contra la pared del tubo. Cuando los grupos ya no sean visibles, vuelva a tapar el tubo.
Sumerja el tubo en un ángulo de 45 grados en un baño de agua ultrasónico durante 5 a 10 segundos. Luego, bajo una campana extractora, agregue cloroformo y metanol a cada tubo para lograr una proporción de metanol a cloroformo a agua de dos a uno a 0.1. Selle los tubos herméticamente y déjelos en la mesa de trabajo hasta el final del día.
Antes de salir esa noche, coloque los tubos bien tapados en un baño de agua de 48 grados centígrados para una incubación durante la noche. Al día siguiente, granular cualquier disolvente y residuos solubles por centrifugación. Luego, en una campana extractora, decanta cuidadosamente el sobrenadante en tubos de ensayo de vidrio de borosilicato de 13 a 100 milímetros preetiquetados inclinados en un ángulo de 30 a 45 grados para facilitar la decantación.
Después de decantar el sobrenadante de todos los tubos, use un concentrador de vacío al vacío máximo con un paso inicial de calentamiento de una hora a 40 grados centígrados para evaporar todo el solvente, luego agregue 500 microlitros de metanol a cada tubo. Para resuspender los extractos lipídicos secos, haga un vórtice del tubo durante 5 a 10 segundos, luego sumerja el tubo en un baño de agua ultrasónico en un ángulo de 45 grados con rotación durante dos minutos. Vuelva a vomercar el tubo durante cinco segundos y vuelva a sumergirlo en el baño de agua ultrasónico durante un minuto adicional.
Retire cualquier residuo insoluble por centrifugación, luego decante el sobrenadante en un vial autoinyector preetiquetado inclinado en un ángulo de 30 a 45 grados para facilitar la decantación. Tapa los viales herméticamente antes de guardarlos a menos 80 grados centígrados hasta el análisis. El análisis de espectrometría de masas en tándem de ionización por electrospray de cromatografía líquida después de la eliminación de OCT confirma que varias especies de ceramidas y monohexosil-ceramidas de longitud de cadena están significativamente elevadas en los tumores de adenocarcinoma de pulmón humano en comparación con los tejidos adyacentes normales no comprometidos.
Los patrones de esfingolípidos eluyen secuencialmente en el siguiente orden: esfingosina d17:1, esfingosina-1-fosfato d17:1, c12 lactosil-ceramida, monohexosil-ceramida C12, esfingomielina C12 y ceramida C12. Para cada una de estas especies de esfingolípidos, utilizando los ajustes de gradiente e instrumentación en el texto, hay un cambio positivo aproximado de 0,15 minutos en el tiempo de retención por cada aumento de dos carbonos en la longitud de la cadena. Sin embargo, los lípidos de longitud de cadena más larga, como C24 y C26, pueden tener cambios de tiempo de retención más grandes.
Además, un doble enlace en el ácido graso a menudo resulta en un cambio negativo de 0,15 minutos en el tiempo de retención. Por lo tanto, la ceramida C18: 1 tendrá un tiempo de retención similar a la ceramida C16. En lugar de depender casi exclusivamente de tejidos recién recolectados, este protocolo amplía las fuentes de tejido que se pueden utilizar para el análisis de espectrometría de masas para incluir aquellos almacenados criogénicamente en biorepositorios.
