Este enfoque detecta cambios en la función contráctil durante el desarrollo de la insuficiencia cardíaca. La respuesta funcional en los miocitos a las neurohormonas y los posibles agentes terapéuticos también se puede examinar. El posicionamiento del miocito puede requerir práctica, pero es esencial para obtener imágenes consistentes de la longitud del sarcómero.
Demostrando el procedimiento está Margaret Westfall, profesora asociada e investigadora principal del laboratorio. Antes de comenzar el experimento, precaliente un paquete de gel y un medio en una incubadora a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Encienda los componentes de la plataforma de función contráctil como se menciona en el manuscrito y ensamble el tubo en la bomba peristáltica.
Luego, transfiera el paquete de gel precalentado al soporte del tubo y encienda el vacío en la alimentación al estimulador celular. Coloque un tubo de 50 mililitros con medios en el soporte del tubo aislado para comenzar la perfusión a 0,5 mililitros por minuto a través del tubo peristáltico de la bomba. A continuación, agregue dos mililitros de medios precalentados a un bote de pesaje pequeño y transfiera un cubreobjetos que contenga miocitos de la cámara de estimulación al bote de pesaje.
Devuelva la cámara de estimulación a la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Retire el cubreobjetos del recipiente de pesaje y limpie suavemente la parte inferior antes de transferirlo a una cámara de cobertura recién engrasada y agregar una gota de medio al cubreobjetos. Coloque un soporte de electrodo de platino sobre el cubreobjetos, luego coloque un nuevo soporte sobre la parte superior con pinzas y coloque un soporte superior sobre el sándwich de cubreobjetos.
Instale dos o cuatro tornillos de cabeza de pancarta número cero para terminar de ensamblar la cámara. En la bomba peristáltica, cuando el medio esté presente en todo el tubo, conecte el tubo al precalentador y el precalentador a la cámara de deslizamiento de la cubierta. Luego, comience la perfusión a 0.5 mililitros por minuto y coloque una toallita de pañuelo debajo de la cámara para asegurarse de que no haya fugas.
Después de colocar la cámara deslizante de la cubierta en el adaptador de etapa del microscopio, encienda el sistema de calentamiento y equilibre el conjunto durante cinco a 10 minutos para lograr una temperatura constante del medio de 37 grados centígrados en el centro de la cámara. Observe los medios perfundidos que se recogen en el extremo opuesto de la cámara con tubos conectados a un sistema de vacío. Durante el tiempo de equilibrio, visualice los miocitos con el objetivo de inmersión en agua 40x en el microscopio.
Para activar el estimulador de ritmo, ajuste el voltaje a 35 a 40 voltios y ajuste la frecuencia de estimulación a 0.2 hertz para optimizar la función contráctil y la supervivencia de los miocitos. Para recopilar rastros de acortamiento de sarcómero, abra el software en la computadora y seleccione OK, Archivo y nuevas pestañas. Prepare una plantilla de pantalla seleccionando rastros, edite los límites de usuario y la longitud del sarcómero.
Grabe las trazas de longitud del sarcómero con el archivo y las nuevas pestañas, identifique un miocito que se contraiga y coloque el miocito a lo largo del eje longitudinal de la cámara para que el patrón de estriación sea vertical. Use el mouse de la computadora para colocar la región de interés o el cuadro de ROI sobre el miocito. Seleccione recopilar y comience a registrar la función contráctil.
Registre el acortamiento durante 60 segundos de cada miocito a bajas frecuencias de estimulación de 0,5 hercios. Registre el acortamiento del sarcómero de cinco a 10 celdas por cubreobjetos. Para medir el acortamiento en un rango de frecuencias, coloque los miocitos en cada frecuencia para obtener un acortamiento en estado estacionario antes de la grabación.
Duplique la tasa de perfusión y comience a registrar de 15 a 20 segundos después de la estimulación a una nueva frecuencia en el rango de 0.2 a dos hercios y registre no más de dos miocitos por cubreobjetos para acortar en el rango dado de frecuencias de estimulación. Registre al menos siete contracciones por celda para obtener datos promediados de señal confiables. Seleccione el archivo, elija un seguimiento grabado y, a continuación, seleccione abrir.
Seleccione la pestaña uno de la traza base y luego establezca el panel amarillo en la parte superior de la traza para obtener la longitud sarc. Prepare una plantilla de análisis con opciones de análisis transitorio monótono de operaciones y marca de evento TTL en la casilla de definición de T Zero en las opciones necesarias del menú. Guarde estas opciones de análisis seleccionando plantillas y guarde la plantilla de análisis con un identificador.
Cargue la plantilla de análisis antes de analizar cada seguimiento. Para analizar los datos, seleccione marcas, puerta, agregue transitorio y luego convierta desde marca de evento y rango de análisis. Establezca el rango de tiempo de menos 0.01 a 1.20 segundos para miocitos con un ritmo de 0.2 hertzios.
Seleccione un rango de tiempo más corto para los miocitos estimulados a frecuencias más altas. Seleccione operaciones y eventos promedio para producir una grabación promediada de señal debajo de la traza base original. A continuación, seleccione la pestaña uno de la traza promediada de señal y luego vaya a marcas en el menú superior seguido de agregar transitorio, elija operaciones y análisis de transitorios monótonos para mostrar los valores promediados de señal para los parámetros de sarcómero de referencia en el panel de visualización promediado de señal.
Seleccione exportar análisis transitorio monótono y corriente del portapapeles y transferir análisis de sarcómero transitorio a una hoja de cálculo para el análisis compuesto de múltiples miocitos. Para copiar la traza promediada de la señal, seleccione exportar, traza actual, luego las pestañas portapapeles y opciones en orden y establezca los decimales en cinco. Elija el delimitador de pestañas y haga clic en Aceptar.
Ajuste el ritmo de las trazas promediadas de la señal para cada grabación de miocitos en una segunda hoja de cálculo. El estudio mostró que la sobrecarga de presión o PO, redujo la función contráctil de los miocitos en comparación con el grupo simulado. Sin embargo, cuatro días después de la transferencia génica de troponina cardíaca IT 144D o cTnIT144D, la capacidad contráctil en los miocitos PO regresó a niveles simulados, lo que indica que la función de los miocitos podría restaurarse.
En los estudios iniciales, la transferencia génica de cTnIT144D mejoró el acortamiento máximo y los niveles elevados de calcio diastólico en comparación con CTnI. A menudo se necesitan ajustes finos en el posicionamiento del miocito cardíaco para obtener trazas claras de acortamiento. Este protocolo también se puede realizar en miocitos cardíacos cargados con colorantes fluorescentes sensibles al calcio como Fura-2 AM para detectar transitorios de calcio además de acortamiento.
