Cette approche détecte les changements dans la fonction contractile au cours du développement de l’insuffisance cardiaque. La réponse fonctionnelle des myocytes aux neurohormones et aux agents thérapeutiques potentiels peut également être dépistée. Le positionnement du myocyte peut prendre de la pratique, mais il est essentiel pour obtenir une imagerie cohérente de la longueur du sarcomère.
Margaret Westfall, professeure agrégée et chercheuse principale du laboratoire, fait la démonstration de la procédure. Avant de commencer l’expérience, préchauffez un pack de gel et un média dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Allumez les composants de la plate-forme de fonction contractile comme mentionné dans le manuscrit et assemblez le tube dans la pompe péristaltique.
Ensuite, transférez le pack de gel préchauffé dans le porte-tube et allumez le vide dans l’alimentation du stimulateur cellulaire. Placez un tube de 50 millilitres avec un média dans le support de tube isolé pour commencer la perfusion à 0,5 millilitre par minute à travers le tube de pompe péristaltique. Ensuite, ajoutez deux millilitres de média préchauffé à un petit bateau de pesage et transférez un couvercle contenant des myocytes de la chambre de stimulation au bateau de pesée.
Remettez la chambre de stimulation dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Retirez le bordereau de couvercle du bateau de pesage et essuyez doucement le dessous avant de le transférer dans une chambre de couvercle fraîchement graissée et d’ajouter une goutte de média sur le couvercle. Placez un support d’électrode en platine sur le couvercle, puis posez un nouveau couvercle sur le dessus avec une pince et placez un support supérieur sur le sandwich du couvercle.
Installez deux ou quatre vis à tête de plateau numéro zéro pour terminer l’assemblage de la chambre. Dans la pompe péristaltique, lorsque le fluide est présent dans tout le tube, fixez le tube au préchauffeur et le préchauffeur à la chambre de glissement du couvercle. Ensuite, commencez la perfusion à 0,5 millilitre par minute et placez une lingette de tissu sous la chambre pour vous assurer qu’il n’y a pas de fuites.
Après avoir placé la chambre de glissement du couvercle dans l’adaptateur de scène du microscope, allumez le système de chauffage et équilibrez l’ensemble pendant cinq à 10 minutes pour atteindre une température constante du milieu de 37 degrés Celsius au centre de la chambre. Observez le fluide perfusé recueilli à l’extrémité opposée de la chambre avec un tube relié à un système de vide. Pendant le temps d’équilibration, visualisez les myocytes avec l’objectif d’immersion dans l’eau 40x au microscope.
Pour activer le stimulateur de stimulation, réglez la tension sur 35 à 40 volts et ajustez la fréquence de stimulation à 0,2 hertz pour optimiser la fonction contractile et la survie des myocytes . Pour collecter des traces de raccourcissement du sarcomère, ouvrez le logiciel sur l’ordinateur et sélectionnez OK, Fichier et Nouveaux onglets. Préparez un modèle d’écran en sélectionnant des traces, modifiez les limites d’utilisateurs et la longueur du sarcomère.
Enregistrez les traces de longueur du sarcomère avec le fichier et les nouveaux onglets, identifiez un myocyte en contraction et positionnez le myocyte le long de l’axe longitudinal de la caméra de sorte que le motif de striation soit vertical. Utilisez la souris de l’ordinateur pour placer la région d’intérêt ou la boîte ROI sur le myocyte. Sélectionnez collecter et commencer à enregistrer la fonction contractile.
Raccourcissement record de 60 secondes de chaque myocyte à de faibles fréquences de stimulation de 0,5 hertz. Raccourcissement record du sarcomère de cinq à 10 cellules par feuillet de couverture. Pour mesurer le raccourcissement sur une gamme de fréquences, placez les myocytes à chaque fréquence pour obtenir un raccourcissement à l’état d’équilibre avant l’enregistrement.
Doublez le taux de perfusion et commencez à enregistrer 15 à 20 secondes après la stimulation à une nouvelle fréquence comprise entre 0,2 et deux hertz et n’enregistrez pas plus de deux myocytes par glissement de couverture pour raccourcir la plage donnée de fréquences de stimulation. Enregistrez au moins sept contractions par cellule pour obtenir des données fiables sur la moyenne du signal. Sélectionnez le fichier, choisissez une trace enregistrée, puis sélectionnez Ouvrir.
Sélectionnez l’onglet un de la trace de base, puis définissez le panneau jaune en haut de la trace pour obtenir la longueur de l’arc. Préparez un modèle d’analyse avec des options d’analyse transitoire monotone et une marque d’événement TTL dans la zone de définition de T Zero dans les options nécessaires du menu. Enregistrez ces options d’analyse en sélectionnant des modèles et enregistrez le modèle d’analyse avec un identifiant.
Chargez le modèle d’analyse avant d’analyser chaque trace. Pour analyser les données, sélectionnez des marques, grille, ajoutez un transitoire puis convertissez à partir de la marque d’événement et de la plage d’analyse. Réglez la plage de temps de moins 0,01 à 1,20 seconde pour les myocytes cadencés à 0,2 hertz.
Sélectionnez une plage de temps plus courte pour les myocytes stimulés à des fréquences plus élevées. Sélectionnez les opérations et les événements moyens pour produire un enregistrement moyen du signal sous la trace de base d’origine. Ensuite, sélectionnez l’onglet un de la trace moyennée du signal, puis accédez à marques dans le menu supérieur, puis ajoutez transitoire, choisissez opérations et analyse transitoire monotone pour afficher les valeurs moyennes du signal pour les paramètres de sarcomère de base dans le panneau d’affichage de la moyenne du signal.
Sélectionnez Exporter l’analyse transitoire monotone et le courant du presse-papiers et transférer l’analyse des sarcomères transitoires dans une feuille de calcul pour l’analyse composite de plusieurs myocytes. Pour copier la trace moyennée du signal, sélectionnez Exporter, Trace actuelle, puis Presse-papiers et onglets Options dans l’ordre et définissez les décimales sur cinq. Choisissez le délimiteur d’onglets et cliquez sur OK.
Rythmez les traces moyennes du signal pour chaque enregistrement de myocytes dans une deuxième feuille de calcul. L’étude a montré que la surcharge de pression ou PO, réduisait la fonction contractile des myocytes par rapport au groupe fictif. Cependant, quatre jours après le transfert du gène de la troponine cardiaque IT 144D ou cTnIT144D, la capacité contractile dans les myocytes PO est revenue à des niveaux simulés, indiquant que la fonction myocytaire pouvait être restaurée.
Dans les études initiales, le transfert de gènes de cTnIT144D a amélioré le raccourcissement maximal et les taux élevés de calcium diastolique par rapport à CTnI. Des ajustements fins dans le positionnement du myocyte cardiaque sont souvent nécessaires pour obtenir des traces de raccourcissement claires. Ce protocole peut également être effectué sur des myocytes cardiaques chargés de colorants fluorescents sensibles au calcium tels que Fura-2 AM pour détecter les transitoires de calcium en plus du raccourcissement.
