Такой подход выявляет изменения сократительной функции во время развития сердечной недостаточности. Функциональная реакция миоцитов на нейрогормоны и потенциальные терапевтические агенты также может быть проверена. Позиционирование миоцита может потребовать практики, но имеет важное значение для получения последовательной визуализации длины саркомера.
Демонстрирует процедуру Маргарет Уэстфолл, доцент и главный исследователь лаборатории. Перед началом эксперимента разогрейте гелевую упаковку и среду в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Включите компоненты платформы с контрактильной функцией, как указано в рукописи, и соберите трубку в перистальтический насос.
Затем перенесите предварительно нагретый гель-пакет в держатель трубки и включите вакуум в питании к клеточному стимулятору. Поместите 50-миллилитровую трубку со средой в изолированный держатель трубки, чтобы начать перфузию со скоростью 0,5 миллилитра в минуту через перистальтическую насосную трубку. Затем добавьте два миллилитра предварительно нагретой среды в небольшую весовую лодку и перенесите один крышку, содержащую миоциты, из стимулирующей камеры в весовую лодку.
Верните камеру стимуляции в инкубатор при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Снимите крышку с весовой лодки и аккуратно протрите нижнюю часть, прежде чем перенести ее в свежесмазанную крышку скользящей камеры и добавить каплю носителя на крышку. Поместите крепление платинового электрода поверх крышки, затем положите новый чехол сверху щипцами и поместите верхнее крепление поверх сэндвича с крышкой.
Установите два или четыре винта с нулевой поддонной головкой, чтобы закончить сборку камеры. В перистальтическом насосе, когда среда присутствует по всей трубке, прикрепите трубку к предпусковому подогревателю, а предпусковой подогреватель к камере скольжения крышки. Затем начните перфузию со скоростью 0,5 миллилитра в минуту и поместите салфетку под камеру, чтобы убедиться в отсутствии утечек.
После размещения крышки скользящей камеры в сценическом адаптере микроскопа включите систему отопления и эквилизуйте узел в течение пяти-10 минут, чтобы достичь постоянной температуры среды 37 градусов Цельсия в центре камеры. Понаблюдайте за перфузированной средой, собираемой на противоположном конце камеры с трубкой, подключенной к вакуумной системе. Во время уравновешивания визуализируйте миоциты с помощью 40-кратного водного объектива на микроскопе.
Чтобы активировать стимулятор темпа, установите напряжение от 35 до 40 вольт и отрегулируйте частоту стимуляции до 0,2 герц для оптимизации сократительной функции и выживаемости миоцитов. Чтобы собрать следы сокращения саркомера, откройте программное обеспечение на компьютере и выберите ОК, файл и новые вкладки. Подготовьте шаблон экрана, выбрав трассировки, отредактировав пользовательские ограничения и длину саркомера.
Запишите следы длины саркомера с помощью файла и новых вкладок, определите сокращающийся миоцит и расположите миоцит вдоль продольной оси камеры, чтобы рисунок полосы был вертикальным. Используйте компьютерную мышь, чтобы поместить интересующую область или поле ROI над миоцитом. Выберите собирать и начать записывать сократительную функцию.
Запись укорочения в течение 60 секунд от каждого миоцита при низких частотах стимуляции 0,5 герц. Рекордное укорочение саркомера от пяти до 10 клеток на крышку. Чтобы измерить укорочение в диапазоне частот, поместите миоциты на каждую частоту, чтобы получить укорочение в устойчивом состоянии перед записью.
Удвоите скорость перфузии и начните запись через 15-20 секунд после стимуляции на новой частоте в диапазоне от 0,2 до двух герц и запишите не более двух миоцитов на проскальзывание крышки для укорочения в заданном диапазоне частот стимуляции. Запишите не менее семи сокращений на клетку, чтобы получить надежные усредненные сигнальные данные. Выберите файл, выберите записанную трассировку и нажмите кнопку Открыть.
Выберите вкладку одна из базовых трассировок, а затем установите желтую панель в верхней части трассировки, чтобы получить длину sarc. Подготовьте шаблон анализа с операциями монотонного переходного анализа и отметкой события TTL в поле определения T Zero в нужных опциях из меню. Сохраните эти параметры анализа, выбрав шаблоны, и сохраните шаблон анализа с идентификатором.
Загрузите шаблон анализа перед анализом каждой трассировки. Чтобы проанализировать данные, выберите метки, ворота, добавьте переходные, а затем преобразуйте из отметки события и диапазона анализа. Установите временной диапазон от минус 0,01 до 1,20 секунды для миоцитов с шагом 0,2 герц.
Выберите более короткий временной диапазон для миоцитов, стимулируемых на более высоких частотах. Выберите операции и средние события, чтобы создать усредненную запись сигнала ниже исходной базовой трассировки. Далее выберите вкладку одна из усредненных трассировок сигнала, а затем перейдите к отметкам в верхнем меню с последующим добавлением переходного периода, выберите операции и монотонный анализ переходных процессов для отображения усредненных значений сигнала для базовых параметров саркомера в панели отображения усредненного сигнала.
Выберите экспорт монотонного переходного анализа и буфера обмена тока и перенесите анализ переходных саркомеров в электронную таблицу для композитного анализа нескольких миоцитов. Чтобы скопировать усредненную трассировку сигнала, выберите экспорт, текущую трассировку, затем буфер обмена и вкладки параметров по порядку и установите десятичные знаки равными пяти. Выберите разделитель вкладок и нажмите кнопку «ОК».
Темп усредненных следов сигнала для каждой записи миоцитов во вторую электронную таблицу. Исследование показало, что перегрузка давлением, или PO, снижает сократительную функцию миоцитов по сравнению с фиктивной группой. Однако через четыре дня после переноса гена сердечного тропонина IT 144D или cTnIT144D сократительная способность в миоцитах PO вернулась к фиктивным уровням, что указывает на то, что функция миоцитов может быть восстановлена.
В первоначальных исследованиях перенос генов cTnIT144D усиливал пиковое укорочение и повышенный уровень диастолического кальция по сравнению с CTnI. Тонкая корректировка в позиционировании сердечного миоцита часто необходима для получения четких следов укорочения. Этот протокол также может быть выполнен на сердечных миоцитах, загруженных чувствительными к кальцию флуоресцентными красителями, такими как Fura-2 AM, для обнаружения переходных процессов кальция в дополнение к укорочению.
