이 접근법은 심부전 발병 중 수축 기능의 변화를 감지합니다. 신경 호르몬 및 잠재적 치료제에 대한 근육 세포의 기능적 반응도 스크리닝 할 수 있습니다. 근세포를 배치하는 것은 연습이 필요할 수 있지만 일관된 근절 길이 영상을 얻는 데 필수적입니다.
이 절차를 시연하는 것은 실험실의 부교수이자 수석 연구원 인 Margaret Westfall입니다. 실험을 시작하기 전에 섭씨 37 도의 인큐베이터에서 젤 팩과 배지를 30 분 동안 예열하십시오. 원고에 언급된 수축 기능 플랫폼 구성 요소를 켜고 튜브를 연동 펌프에 조립합니다.
그런 다음 예열 된 젤 팩을 튜브 홀더로 옮기고 세포 자극기의 진공을 켭니다. 절연 튜브 홀더에 매체가 있는 50밀리리터 튜브를 놓아 연동 펌프 튜브를 통해 분당 0.5밀리리터의 관류를 시작합니다. 다음으로, 예열된 배지 2ml를 소형 계량 보트에 추가하고 근세포가 포함된 커버 슬립 1개를 자극 챔버에서 계량 보트로 옮깁니다.
자극 챔버를 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소의 인큐베이터로 되돌립니다. 계량 보트에서 커버 슬립을 제거하고 밑면을 부드럽게 닦은 후 새로 그리스를 칠한 커버 슬립 챔버로 옮기고 커버 슬립에 미디어 한 방울을 추가합니다. 커버 슬립 위에 백금 전극 마운트를 놓은 다음 집게로 상단 위에 새 커버 슬립을 놓고 커버 슬립 샌드위치 위에 상단 마운트를 놓습니다.
2개 또는 4개의 제로 팬헤드 나사를 설치하여 챔버 조립을 완료합니다. 연동 펌프에서 매체가 튜브 전체에 존재할 때 튜브를 예열기에 부착하고 예열기를 커버 슬립 챔버에 부착합니다. 그런 다음 분당 0.5ml로 관류를 시작하고 누출이 없는지 확인하기 위해 챔버 아래에 티슈 닦음을 놓습니다.
커버 슬립 챔버를 현미경의 스테이지 어댑터에 놓은 후 가열 시스템을 켜고 5-10분 동안 어셈블리를 평형화하여 챔버 중앙에서 섭씨 37도의 일정한 매체 온도를 달성합니다. 진공 시스템에 연결된 튜브로 챔버의 반대쪽 끝에서 수집되는 관류 매체를 관찰하십시오. 평형 시간 동안 현미경에서 40x 물 침지 대물렌즈로 근세포를 시각화합니다.
페이싱 자극기를 활성화하려면 전압을 35-40V로 설정하고 자극 주파수를 0.2Hz로 조정하여 수축 기능과 근세포 생존을 최적화하십시오. 근절 단축 추적을 수집하려면 컴퓨터에서 소프트웨어를 열고 확인, 파일 및 새 탭을 선택하십시오. 추적을 선택하고 사용자 제한 및 근본 길이를 편집하여 화면 템플릿을 준비합니다.
파일 및 새 탭으로 근절 길이 추적을 기록하고, 수축하는 근세포를 식별하고, 줄무늬 패턴이 수직이 되도록 카메라의 세로축을 따라 근세포를 배치합니다. 컴퓨터 마우스를 사용하여 관심 영역 또는 ROI 상자를 근세포 위에 놓습니다. 수집 및 시작을 선택하여 수축 기능을 기록합니다.
0.5 헤르츠의 낮은 자극 주파수에서 각 근육 세포에서 60 초 동안 단축을 기록합니다. 표지 전표 당 5 개에서 10 개의 세포로 근절 단축을 기록하십시오. 주파수 범위에서 단축을 측정하려면 각 주파수에 근세포를 배치하여 기록 전에 정상 상태 단축을 얻습니다.
관류 속도를 두 배로 늘리고 자극 후 0.2-2 헤르츠 범위의 새로운 주파수에서 15-20 초 동안 기록을 시작하고 주어진 자극 주파수 범위에서 단축하기 위해 커버 슬립 당 2 개 이하의 근육 세포를 기록합니다. 신뢰할 수 있는 신호 평균 데이터를 얻기 위해 셀당 최소 7개의 수축을 기록합니다. 파일을 선택하고 기록된 추적을 선택한 다음 열기를 선택합니다.
기본 추적 중 하나를 탭으로 선택한 다음 추적 맨 위에 노란색 패널을 설정하여 sarc 길이를 가져옵니다. 메뉴에서 필요한 옵션의 T Zero 상자 정의에 작업 단조 과도 분석 옵션 및 TTL 이벤트 표시가있는 분석 템플릿을 준비합니다. 템플릿을 선택하여 이러한 분석 옵션을 저장하고 분석 템플릿을 식별자와 함께 저장합니다.
각 추적을 분석하기 전에 분석 템플릿을 로드합니다. 데이터를 분석하려면 마크, 게이트를 선택하고 과도 상태를 추가한 다음 이벤트 마크 및 분석 범위에서 변환합니다. 0.2Hz에서 진행되는 근세포의 시간 범위를 마이너스 0.01초에서 1.20초 사이로 설정합니다.
더 높은 주파수에서 자극되는 근육 세포에 대해 더 짧은 시간 범위를 선택하십시오. 작업 및 평균 이벤트를 선택하여 원래 기본 트레이스 아래의 신호 평균 기록을 생성합니다. 그런 다음 신호 평균 트레이스 중 하나를 탭한 다음 상단 메뉴의 표시로 이동한 다음 과도 상태 추가, 작업 및 단조 과도 분석을 선택하여 신호 평균 디스플레이 패널에 기준선 육종 파라미터에 대한 신호 평균 값을 표시합니다.
단조 과도 분석 및 클립보드 전류 내보내기를 선택하고 과도 근절 분석을 스프레드시트로 전송하여 여러 근세포의 복합 분석을 수행합니다. 신호 평균 트레이스를 복사하려면 내보내기, 현재 트레이스, 클립보드 및 옵션 탭을 순서대로 선택하고 소수 자릿수를 5로 설정합니다. 탭 구분 기호를 선택하고 확인을 클릭합니다.
각 근세포 기록에 대한 신호 평균 트레이스의 속도를 두 번째 스프레드시트로 조정합니다. 이 연구는 압력 과부하 또는 PO가 가짜 그룹과 비교할 때 근육 세포의 수축 기능을 감소 시킨다는 것을 보여주었습니다. 그러나, 심장 트로포 닌 IT 144D 또는 cTnIT144D의 유전자 전달 4 일 후, PO 근육 세포의 수축 능력은 가짜 수준으로 돌아 왔으며, 이는 근육 세포 기능이 회복 될 수 있음을 나타낸다.
초기 연구에서 cTnIT144D의 유전자 전달은 CTnI에 비해 피크 단축 및 이완기 칼슘 수치 상승을 향상시켰습니다. 명확한 단축 흔적을 얻기 위해 심장 근육 세포의 위치를 미세 조정해야합니다. 이 프로토콜은 Fura-2 AM과 같은 칼슘에 민감한 형광 염료가 로딩 된 심장 근육 세포에서도 수행하여 단축 외에도 칼슘 과도 현상을 감지 할 수 있습니다.
