El análisis de las células de población lateral es uno de los métodos comúnmente utilizados para aislar e identificar las células madre cancerosas de los tejidos tumorales y las líneas celulares tumorales. Este ensayo es conveniente, rápido y rentable. Este método puede contribuir a una mejor comprensión del efecto de los genes u otras señales extracelulares e intracelulares sobre las propiedades de vástago de las células tumorales.
Muchos factores pueden influir en el porcentaje de células SP en este análisis, por lo que es fundamental explorar las condiciones adecuadas antes del experimento formal. Sembrar células tumorales en una placa de seis pozos e incubarlas en una incubadora de 37 grados Celsius suministrada con dióxido de carbono al 5%. Cuando la densidad celular alcanza aproximadamente el 90%, aspire el medio de cultivo, y lave las células dos veces con tres mililitros de PBS.
Luego, agregue 500 microlitros de 0.25% de tripsina-EDTA a cada pocillo, e incube la placa a 37 grados Celsius durante uno a tres minutos. Toque suavemente la placa para separar las células, agregue tres mililitros de PBS complementados con 2% de FBS a cada pocillo, y pipetee las células hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces para dispersar los grupos celulares. Examine la suspensión celular bajo el microscopio.
Si los grupos celulares están presentes, pase la suspensión a través de un colador de 70 micrómetros. Transfiera las células a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y centrífugalas a 200 veces g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y resuspend las células en tres mililitros de PBS suplementados con 2% FBS, pipeteando las células hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces para mezclar.
Cuente las células bajo el microscopio usando un hemocytometer, y diluyalas en PBS complementado con el 2%FPS a una concentración final de una vez 10 a las seis células por mililitro. Prepare dos tubos de ensayo de cinco mililitros, poliestireno y fondo redondo y agregue un mililitro de la suspensión celular a cada tubo. Etiquete un tubo como tubo de ensayo y el otro como tubo de control bloqueador.
Prepare una solución de bloqueador diluyendo a la concentración adecuada. Añádalo al tubo de control del bloqueador y mezcle bien, luego incube el tubo a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Agite el tubo cada 10 minutos.
Prepare una solución de Hoechst 33342 diluyéndola a la concentración adecuada. Añádalo al tubo de ensayo y al tubo de control del bloqueador por separado y mezcle bien, luego incube los tubos a 37 grados Celsius durante 60 minutos. Agite los tubos cada 10 minutos.
Después de la incubación, centrifugar las células durante cinco minutos a 200 veces g y cuatro grados Centígrados, luego aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Resuspend las células en cada tubo con un mililitro de PBS helado complementado con 2% FBS, luego pipetear las células hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Agregue un microlitro de yoduro de propidio de un miligramo por mililitro, o PI, a cada tubo y mezcle.
Haga clic en la pestaña Parámetros en el software del citómetro de flujo. En primer lugar, elija los parámetros de FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red y PI, respectivamente. En segundo lugar, elija la escala logarítmica para el parámetro PI.
Finalmente, elija escalas de área y ancho para los parámetros FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red y PI, respectivamente. Ejecute primero las celdas del tubo de ensayo y, a continuación, ejecute las celdas desde el tubo de control del bloqueador utilizando los mismos voltajes y puertas. Recopile de 20 a 100,000 eventos de cada muestra para analizar el porcentaje de células SP.
Este método fue utilizado para detectar la proporción de células del SP en la variedades de células humanas del cáncer de seno MDA-MB-231. La gráfica de puntos de FSC-A versus PI-A mostró una población de células muertas, restos celulares y la población principal de células IP negativas, que fue sometida a análisis adicionales. Se utilizó una población unicelular cerrada a partir de la gráfica de puntos de FSC-A versus FSC-W y la gráfica de puntos de SSC-A versus SSC-W para analizar la proporción de células SP, que fue de aproximadamente 0,9% en células no tratadas y de aproximadamente 0,09% en células tratadas con reserpina.
Diversas concentraciones de coloración de Hoechst 33342 fueron probadas en las células MDA-MB-435, y fue determinado que dos microgramos por mililitro eran óptimos para el análisis del SP. Las concentraciones bajas hicieron difícil distinguir las células del SP de otras poblaciones, mientras que las altas concentraciones causaron que las células del SP desaparecieran. El verapamilo y la reserpina fueron probados para determinar el molde apropiado para las células MDA-MB-435.
Alrededor del 0,4% de las células expulsaron el tinte después del tratamiento con verapamilo, pero la proporción se redujo a aproximadamente el 0,1% después del tratamiento con reserpina, lo que demuestra que la reserpina es un bloqueador más apropiado para esta línea celular. Este protocolo también se utilizó para determinar la proporción de células SP en células de adenocarcinoma de pulmón humano A549 tratadas con colivelina activadora STAT3 y en células de cáncer de mama humano T47D tratadas con el inhibidor de FRA1 SKLB816. Este ensayo proporciona pistas sobre el efecto regulador de las vías de señalización en las características de las células madre cancerosas y facilita el descubrimiento de nuevos mecanismos, que en última instancia pueden guiar la terapia dirigida de los tumores.
