Este método para la disección y la inmunofluorescencia es utilizado por muchos laboratorios de C. elegans. Se puede adoptar para detectar cualquier proteína para la que esté disponible un anticuerpo o una proteína de fusión marcada. Aunque se requiere algo de práctica para obtener esta disección correcta, este protocolo es flexible y sencillo de solucionar.
Para nosotros, la tinción DAPI siempre funciona y, por lo general, podemos encontrar una condición que funcione para cada anticuerpo. El mayor desafío para esta técnica es el paso de disección. Tienes que trabajar rápido pero con confianza para obtener buenas extrusiones de la línea germinal.
La práctica es clave. Para comenzar, coloque un portaobjetos de sujeción en el escenario de un microscopio de disección y coloque el cubreobjetos encima del portaobjetos de sujeción. Luego, pipetea cuatro microlitros de la solución de disección en el centro del cubreobjetos y mueve la diapositiva de sujeción a un lado del escenario para liberar la vista.
Escoja de 10 a 20 hermafroditas de una placa NGM en la gota de solución de disección. Es mejor elegir aproximadamente 10 por diapositiva, pero no tantas que no se puedan diseccionar en cinco minutos. Para diseccionar a los animales, cruce las puntas de las agujas para hacer una forma de X y use la parte inferior de la X para sujetar a un adulto a la superficie del cubreobjetos.
Luego, coloque la forma de X inmediatamente detrás de la faringe, aproximadamente una quinta parte de la longitud del cuerpo de un adulto joven o justo debajo de la parte clara de la cabeza. Luego, decapitar al animal con un movimiento de tijera, liberando completamente de la cavidad corporal, junto con una o ambas mitades del intestino. Para fijar la muestra con formaldehído, pipetear cuatro microlitros de la solución de fijación en el cubreobjetos, muy cerca de la gota con animales, evitando pipetear directamente en la gota de disección y desplazar las canales disecadas.
Fije el cubreobjetos a la corredera de sujeción con un dedo. Con la otra mano, mueva suavemente el cubreobjetos varias veces para mezclar las gotas. Sosteniendo una diapositiva cargada positivamente con el lado frontal hacia abajo, úsela para recoger el cubreobjetos en el centro de la diapositiva tocando suavemente la gota de muestra, y la tensión superficial de la gota recogerá el cubreobjetos.
Coloque la corredera en el banco y fíjela durante exactamente cinco minutos a temperatura ambiente. Durante este tiempo, etiquete la diapositiva con un lápiz. Para congelar la muestra con nitrógeno líquido mientras sostiene el borde etiquetado del portaobjetos con pinzas, bájelo suavemente en nitrógeno líquido.
Suelte la diapositiva, de modo que se apoye contra el costado del vaso de precipitados con el cubreobjetos hacia arriba, y las diapositivas se congelan en 10 segundos. Si usa hielo seco para congelar, después de raspar la escarcha de la superficie del bloque de aluminio con una navaja de afeitar, sostenga firmemente el borde etiquetado del portaobjetos y colóquelo en la superficie despejada, aplicando algo de presión hacia abajo para garantizar el contacto total con el bloque. La congelación ocurre dentro de los 10 segundos cuando la muestra debajo del cubreobjetos se convierte en hielo.
Retire la corredera congelada agarrando firmemente el borde corto etiquetado de la corredera y apoye un borde largo contra el banco. Con la otra mano, agarre firmemente una navaja de afeitar y deslice el borde de la navaja por el portaobjetos para mover el cubreobjetos y alejarlo de la muestra. Coloque inmediatamente el portaobjetos en un frasco de Coplin que contenga 95% de etanol y deje los portaobjetos en etanol durante al menos cinco minutos.
Luego, lave las diapositivas en PBST tres veces durante cinco minutos cada una a temperatura ambiente, mientras usa PBST fresco para cada lavado. Los resultados de las imágenes de fluorescencia de los núcleos de la línea germinal demostraron que DAPI se une fuertemente al ADN. La tinción de inmunofluorescencia fue efectiva cuando el anticuerpo dirigido a RAD-51, un marcador de roturas de doble cadena, estaba presente como focos discretos dentro de núcleos mióticos, colocalizados en cromosomas marcados por DAPI.
Los mutantes heterocigotos kle-2 tienen defectos menores en la estructura cromosómica, como lo demuestra la tinción DAPI ligeramente desordenada y un aumento en el número de rotura de doble cadena, lo que se refleja en el mayor número de focos de RAD-51. Tanto los pasos de disección como los de congelación pueden ser complicados, por lo que es importante trabajar de forma rápida y sin problemas. Recomendamos practicar estos pasos antes de intentar todo el protocolo.
Por ejemplo, podría practicar la disección en un volumen mayor de líquido, como 200 microlitros, y trabajar gradualmente hasta nuestro volumen recomendado de cuatro microlitros en un cubreobjetos. Esta técnica se puede utilizar para imágenes de alta resolución en un microscopio de iluminación confocal o estructurado, o se puede utilizar en combinación con ADN o RNA-FISH, hibridación fluorescente in situ, para visualizar cómo se localizan las proteínas en relación con secuencias específicas.
