שיטה זו לדיסקציה ואימונופלואורסצנציה משמשת מעבדות C.elegans רבות. ניתן לאמץ אותו כדי לזהות כל חלבון שנוגדן או חלבון היתוך מתויג זמינים עבורו. למרות שזה דורש קצת תרגול כדי לקבל את זה ניתוח נכון, פרוטוקול זה הוא גמיש ופשוט לפתור בעיות.
עבורנו, צביעת DAPI תמיד עובדת ובדרך כלל אנו יכולים למצוא מצב שעובד עבור כל נוגדן. האתגר הגדול ביותר בטכניקה זו הוא שלב הנתיחה. אתה צריך לעבוד במהירות אבל בביטחון כדי לקבל הבלטה germline טוב.
תרגול הוא המפתח. כדי להתחיל, הנח שקופית אחיזה על הבמה של מיקרוסקופ מנתח והנח את הכיסוי על גבי שקופית האחיזה. לאחר מכן, הזיזו ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת החיתוך למרכז הכיסוי והזיזו את מגלשת האחיזה לצד אחד של הבמה כדי לפנות את הנוף.
בחר 10 עד 20 הרמפרודיטים מצלחת NGM לתוך טיפת תמיסת הניתוח. עדיף לבחור בערך 10 לכל שקופית אבל לא כל כך הרבה שלא ניתן לנתח אותם תוך חמש דקות. כדי לנתח את החיות, חצו את נקודות המחטים כדי ליצור צורת X והשתמשו בתחתית ה-X כדי להצמיד מבוגר אל פני השטח של הכיסוי.
לאחר מכן, מקם את צורת ה- X מיד מאחורי הלוע, כחמישית מאורך גופו של מבוגר צעיר או ממש מתחת לחלק הברור של הראש. לאחר מכן, לערוף את החיה בתנועת מספריים אחת, ולשחרר באופן מלא מחלל הגוף, יחד עם אחד או שני חצאי המעיים. כדי לתקן את הדגימה עם פורמלדהיד, פיפטה ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת התיקון על הכיסוי, קרוב מאוד לטיפה עם בעלי חיים, תוך הימנעות פיפטה ישירות לתוך טיפת דיסקציה ועקירת הפגרים המנותקים.
הצמד את הכיסוי לשקופית ההחזקה באמצעות אצבע אחת. ביד השנייה, הזיזו בעדינות את הכיסוי כמה פעמים כדי לערבב את הטיפות. החזקת מגלשה טעונה חיובית בצד הקדמי כלפי מטה, השתמש בה כדי להרים את הכיסוי במרכז המגלשה על ידי נגיעה עדינה בטיפת הדגימה, ומתח הפנים של הטיפה ירים את הכיסוי.
מניחים את המגלשה על הספסל ומתקנים במשך חמש דקות בדיוק בטמפרטורת החדר. במהלך תקופה זו, תייג את השקופית בעיפרון. כדי להקפיא את הדגימה באמצעות חנקן נוזלי תוך החזקת הקצה המסומן של המגלשה בפינצטה, הורידו אותה בעדינות לחנקן נוזלי.
שחררו את השקופית, כך שהיא תישען על צד הכוס כשצד הכיסוי כלפי מעלה, והשקופיות מוקפאות תוך 10 שניות. אם אתם משתמשים בקרח יבש כדי לקפוא, לאחר גירוד הכפור מפני השטח של גוש האלומיניום בעזרת סכין גילוח, החזיקו היטב את הקצה המסומן של המגלשה והניחו אותו על המשטח המנוקה, תוך הפעלת לחץ כלפי מטה כדי להבטיח מגע מלא עם הבלוק. הקפאה מתרחשת תוך 10 שניות כאשר הדגימה מתחת לכיסוי הופכת לקרח.
הסר את השקופית הקפואה על-ידי אחיזה חזקה בקצה הקצר המסומן של המגלשה, והצמד קצה ארוך אחד לספסל. ביד השנייה, אחזו בחוזקה בתער והחליקו את קצה סכין הגילוח במורד המגלשה כדי להסיר את הכיסוי מהדגימה ולהרחיק אותה. הניחו מיד את השקופית בצנצנת קופלין המכילה 95% אתנול, והשאירו את השקופיות באתנול למשך חמש דקות לפחות.
לאחר מכן, יש לשטוף את השקופיות ב-PBST שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת בטמפרטורת החדר, תוך שימוש ב-PBST טרי לכל כביסה. תוצאות הדמיה פלואורסצנטית של גרעיני חיידקים הראו כי DAPI נקשר בחוזקה לדנ"א. צביעה אימונופלואורסצנטית הייתה יעילה כאשר הנוגדן המכוון ל-RAD-51, סמן לשברים דו-גדיליים, היה נוכח כמוקדים בדידים בתוך גרעינים מיוטיים, שעברו לוקליזציה משותפת על כרומוזומים המסומנים על ידי DAPI.
למוטנטים של kle-2 heterozygotes יש פגמים קלים במבנה הכרומוזומים, כפי שמוצג על ידי צביעת DAPI מעט לא מסודרת ועלייה במספר השבירה הדו-גדילי, המשתקפת במספר הגבוה יותר של מוקדי RAD-51. גם שלבי ההסרה וגם שלבי הסדק בהקפאה יכולים להיות מסובכים ולכן חשוב לעבוד במהירות ובצורה חלקה. אנו ממליצים לתרגל שלבים אלה לפני שתנסה את הפרוטוקול כולו.
לדוגמה, אתה יכול לתרגל כריתה בנפח גדול יותר של נוזל, כמו 200 מיקרוליטרים, ובהדרגה לרדת לנפח המומלץ שלנו של ארבעה מיקרוליטרים במחליק כיסוי. טכניקה זו יכולה לשמש להדמיה ברזולוציה גבוהה במיקרוסקופ תאורה קונפוקלי או מובנה, או שניתן להשתמש בה בשילוב עם DNA או RNA-FISH, הכלאה פלואורסצנטית באתרה, כדי לדמיין כיצד חלבונים מתמקמים ביחס לרצפים ספציפיים.
