Damos las gracias a Shanghai Tolo Biotech por su asistencia técnica durante el desarrollo de la norma C-Brick. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Investigación Prioritaria Estratégica de la Academia China de Ciencias (Grant No. XDB19040200).

1. Preparación de CRRNA <ol><li> Preparación de plantillas de CRRNA <ol><li> Re-suspender los oligonucleótidos individuales ( Tabla 1 ) en agua libre de RNasa a una concentración de 10 μM. </li><li> Se a~naden 22,5 μl de oligonucleótido de hebra superior (T7-F en la Tabla 1 ), 22,5 μl de oligonucleótido de cadena inferior ( Tabla 1 ) y 5 μl de tampón de recocido 10x a un tubo de PCR de 0,2 ml. Asegúrese de que el volumen total es de 50 μl. NOTA: En la Tabla 1 se muestran seis oligonucleótidos diferentes de hebras inferiores, cada uno de los cuales debería estar emparejado individualmente con la hebra superior T7-F. Las letras minúsculas de la Tabla 1 representan la secuencia a transcribir en la secuencia guía de CRRNA. Se puede usar tampón Taq PCR 10x en lugar del tampón de recocido 10x. </li><li> Coloque el tubo de PCR en un termociclador. </li><li> Ejecutar el programa de recocido: desnaturalización inicial a 95 ° C para5 min y luego un tiempo de reutilización de 95-20 ° C, con una disminución de 1 ° C por minuto en el termociclador. NOTA: Utilice inmediatamente las muestras para el paso 1.2.1. </li></ol></li><li> Transcripción y purificación de CRRNA <ol><li> Se añaden 38 μl de agua libre de RNasa, 8 μl de la plantilla de la etapa 1.1.4, 20 μl de tampón de transcripción 5x T7, 20 μl de mezcla NTP (10 μM), 4 μl de inhibidor RNasa recombinante (RRI) y 10 μL Μl de ARN polimerasa T7 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Asegúrese de que el volumen total es de 100 μL. </li><li> Se pone el tubo de microcentrífuga en un baño de agua a 37 ° C durante la noche (durante aproximadamente 16 h). </li><li> Utilice un kit de limpieza y concentración de ARN para purificar el ARN transcrito; Siga el protocolo del fabricante. </li><li> Cuantificar los ARNs con espectrofotómetros UV-Vis y diluir el ARN a una concentración de 10 μ M. Utilice las muestras inmediatamente o almacénelas a -80 ° C. NOTA: La secuencia de CRRNAS se enumeran en la Tabla 2 . </li></ol></li></ol> 2. Construcción de piezas de C-Brick ( es decir, la inserción de partes biológicas en un vector estándar de C-Brick) NOTA: Este paso tiene tres sub-pasos. Para las partes biológicas cortas ( por ejemplo, promotores y terminadores), es mejor utilizar el método de PCR directa para insertar las partes biológicas en un vector estándar de C-Brick 4 . La secuencia completa del vector se muestra en los datos suplementarios, y la secuencia de prefijo y sufijo se muestra en la Figura 1 (paso 2.1, más adelante). Para las partes biológicas que pueden obtenerse fácilmente mediante PCR ( por ejemplo, con plantillas de ADN genómico, plásmidos o secuencias de ADN sintetizadas de novo ), es mejor utilizar el método de ensamblaje sin costuras para insertar las partes biológicas en un vector estándar de C-Brick (Paso 2.2, más adelante). Para las partes obtenidas de las normas BioBrick y BglBrick, la restricciónSe puede usar la digestión mediada por enzima y la ligación mediada por ligasa de T4-ADN para insertar las partes biológicas en un vector estándar de C-Brick (etapa 2.3, más adelante). <ol><li> Construcción mediante amplificación directa por PCR <ol><li> Diseñar y ordenar oligonucleótidos para la amplificación por PCR. NOTA: El extremo 5 &#39;del oligonucleótido contiene la secuencia de la parte de ADN, y el extremo 3&#39; del oligonucleótido contiene la secuencia del vector ( es decir, &quot;GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG&quot; en el extremo 3 &#39;de la hebra delantera y &quot;GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG&quot; En la cadena inversa). En el extremo 5 &#39;del oligonucleótido no se puede diseñar ningún saliente ni un saliente de 20 pb. Ejemplos específicos se pueden encontrar en un estudio previo 4 . </li><li> Re-suspender oligonucleótidos individuales en agua ultra pura a una concentración de 10 μ M. </li><li> Preparar reacciones de PCR en hielo en un tubo de PCR de 0,2 ml: añadir 18 μl de agua ultra pura, 25 μL de 2x P1 μl de dNTPs (10 μM), 2,5 μl de cada uno de los cebadores directos e inversos (10 μM) del paso 2.1.2, 0,5 μl de vector estándar C-Brick (50 ng) como molde y 0,5 μl De DNA polimerasa de alta fidelidad. Asegúrese de que el volumen total es de 50 μl. </li><li> Coloque el tubo directamente en un termociclador e inicie el programa del termociclador. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C. </li><li> Programa termociclador: un ciclo durante 3 min a 98 ° C; Treinta ciclos durante 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C y 2 min a 72 ° C; Y un ciclo durante 10 min a 72 ° C. Mantenga la muestra a 16 ° C. </li><li> Añadir 9 μl de la mezcla de la etapa 2.1.4 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Añadir 1 μl de DpnI e incubar durante 1 h en un baño de agua a 37 ° C. NOTA: Si los cebadores no tienen secuencias solapadas, añada 0,5 μL de polinucleótido quinasa T4 (PNK) y 0,5 μL de T4 DNA ligasa e incube enUn baño de agua a 22 ° C durante 1 h. De lo contrario, si los cebadores contienen una secuencia de superposición de ~ 20 nt, transformar directamente los productos tratados con DpnI en células compatibles con E. coli (DH10B) (etapa 2.4). El producto de PCR linealizado será circularizado por el sistema de recombinación en el huésped. </li><li> Utilice las muestras inmediatamente o guárdelas a -20 ° C. </li></ol></li><li> Construcción a través de un montaje sin fisuras <ol><li> Diseñar y ordenar oligonucleótidos para la amplificación por PCR. NOTA: El extremo 3 &#39;del oligonucleótido contiene la secuencia terminal de la parte de ADN y el extremo 5&#39; del oligonucleótido contiene el terminal de la secuencia de vector estándar linealizada de C - Brick ( es decir, &quot;CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC&quot; para el extremo 5 &#39; -end de la cadena delantera y &quot;CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC&quot; para el extremo 5 &#39;de la cadena inversa). Ejemplos específicos se pueden encontrar en un estudio previo 4 . </li><li> Re-suspender el individuoUal en agua ultrapura a una concentración de 10 μM. </li><li> Preparar reacciones de PCR en hielo en un tubo de PCR de 0,2 ml: añadir 18 μl de agua ultra pura, 25 μL de tampón de PCR 2x, 1 μl de dNTP (10 μM), 2,5 μl de cada uno de los cebadores directos e inversos (10 μM ) De la etapa 2.2.2, 0,5 μl de plantilla (20-500 ng) y 0,5 μl de ADN polimerasa de alta fidelidad. Asegúrese de que el volumen total es de 50 μl. </li><li> Coloque el tubo directamente en el termociclador y ejecute el programa del termociclador. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C. NOTA: Ajuste el programa del termociclador a: un ciclo durante 3 min a 98 ° C; 30 ciclos durante 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C (según la temperatura de recocido del cebador) y 1 min (según la longitud de las partes biológicas) a 72 ° C; Y un ciclo durante 10 min a 72 ° C. Mantenga la muestra a 16 ° C. </li><li> Purificar el producto de PCR utilizando un sistema de limpieza de PCRKit de temperatura; Siga el protocolo del fabricante. </li><li> Digerir el vector estándar C-Brick con BamHI: añadir 34 μl de agua ultra pura, 10 μL de plásmido (1 μg), 5 μL de tampón 10x y 1 μl de BamHI al tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Purificar el producto anterior usando un kit de sistema de limpieza de gel; Siga el protocolo del fabricante. </li><li> Añadir 2 μl de vector linealizado (50 ng) de la etapa 2.2.7, 5 μl de fragmento (200 ng) de la etapa 2.2.4, 2 μl de tampón de ensamblaje sin costura 5x y 1 μl de enzima de ensamblaje sin costura de un kit de ensamblaje sin costura A un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Asegúrese de que el volumen total es de 10 μl. </li><li> Colocar esto en un baño de agua a 37 ° C durante 30 min. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C. </li></ol></li><li> Construcción mediante digestión mediada por enzimas de restricción y ligación mediada por ligasa de T4 ADN. NOTA: Para las partes obtenidas de las normas BioBrick (etapa 2.3.4-2.3.7) y BglBrick (etapa 2.3.1-2.3.3), se puede utilizar la digestión mediada por enzimas de restricción y la ligación mediada por ligasa de T4-ADN para insertar la Biológicas en un vector estándar de C-Brick. <ol><li> Digerir las partes estándar de BglBrick con BamHI y BglII: añadir 34 μl de agua ultra pura, 10 μL de plásmido (2 μg), 5 μL de tampón 10x, 0,5 μL de BamHI y 0,5 μL de BglII en el tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Ejecutar una electroforesis en gel de agarosa al 1% y purificar el fragmento usando un kit de sistema de limpieza de gel. </li><li> Ligar el fragmento y el vector estándar de C-Brick: añadir 2 μl de vector linealizado (50 ng) de la etapa 2.1.12 y 6 μl de fragmento (200 ng) de la etapa 2.3.3 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 1 μ l de 10 x T4 ADN ligasa buffer y 1 μ l de T4 DNA ligase. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Utilice las muestras inmediatamente o freezE y almacenarlos a -20 ° C. </li><li> Digerir las partes estándar de BioBrick con XbaI y SpeI: añadir 34 μL de agua ultra pura, 10 μL de plásmido (2 μg), 5 μL de tampón 10x, 0,5 μL de XbaI y 0,5 μL de SpeI al tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Digerir el vector estándar de C-Brick con XbaI y SpeI: añadir 34 μL de agua ultrapura, 10 μL de plásmido (1 μg), 5 μl de tampón 10x, 0,5 μL de XbaI y 0,5 μl de SpeI al tubo de microcentrífuga . Incubar durante 2 h en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Ejecutar una electroforesis en gel de agarosa al 1% y purificar el fragmento de la etapa 2.3.4 y el vector linealizado de la etapa 2.3.5 con un kit de sistema de limpieza de gel; Siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Ligar el fragmento y el vector C-Brick: añadir 2 μl de vector linealizado (50 ng) de la etapa 2.3.5 y 6 μl de fragmento (200 ng) de la etapa 2.3.4 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. AnuncioD 1 μl de tampón de ADN ligasa 10 x T4 y 1 μl de ADN ligasa T4. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C. </li></ol></li><li> Añadir 10 μl de los productos de la etapa 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 o 2.3.7 para la transformación química en las células competentes de E. coli (DH10B). </li><li> Recoger varios clones a un líquido de 5 ml Luria-Bertani (LB) tubo e incubar a 37 ° C en un agitador (220 rpm) durante la noche. </li><li> Extraer el plásmido usando un kit de preparación de plásmido; Siga el protocolo del fabricante. </li><li> Identificar los clones correctos mediante la secuenciación de Sanger 11 . </li></ol> 3. Ensamblaje del C-Brick ( Figura 2 ) <ol><li> Digestión del vector C-Brick con Cpf1 <ol><li> Añadir 22,5 μl de agua libre de RNasa, 4 μl de tampón Cpf1 10x, 10 μl del plásmido de la etapa 2.6 (1 μg), 0,5 μL de RRI y 1 μg de# 181; L de Cpf1 (5 μM) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. NOTA: Cpf1 puede adquirirse comercialmente o purificarse siguiendo el protocolo en un estudio previo 4 . </li><li> Para insertar un fragmento de ADN extraño en los sitios T1 y T2, añadir 1 μl de CRRNA-T2 (10 μM) e incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 30 min. A dd 1 μ l de CRRNA-T1 (10 μ M) y Cpf1 (5 μ M) durante otros 30 min. NOTA: Alternativamente, para insertar un fragmento de ADN extraño en los sitios T3 y T4, añadir 1 μl de CRRNA-T3 (10 μM) e incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 30 minutos. Añadir 1 μ l de CRRNA-T4 (10 μ M) durante otros 30 min. </li><li> Añadir 1 μl de fosfatasa alcalina termosensible e incubar el tubo en un baño de agua a 37 ° C durante otras 1 h. </li><li> Ejecutar una electroforesis en gel de agarosa y purificar el vector utilizando un kit de sistema de limpieza de gel. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C. </li></ol></Li <li> La digestión del fragmento de ADN con Cpf1 <ol><li> Añadir 21,5 μl de agua libre de RNasa, 4 μl de tampón Cpf1 10x, 10 μL de plásmido de la etapa 2.6 (2 μg), 0,5 μL de RRI y 2 μl de Cpf1 (5 μM) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Para insertar un fragmento de ADN extraño en los sitios T1 y T2, añadir 1 μl de CRRNA-T1 (10 μM) y 1 μl de CRRNA-T3 (10 μM) e incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 2 h. NOTA: Alternativamente, añada 1 μl de CRRNA-T2 (10 μM) y 1 μl de CRRNA-T4 (10 μM) e incube en un baño de agua a 37 ° C durante 2 h. </li><li> Ejecutar una electroforesis en gel de agarosa y purificar el fragmento usando un kit de sistema de limpieza de gel. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C. </li></ol></li><li> Ensamblaje de C-Brick y verificación adicional <ol><li> Ligar el fragmento de ADN extraño y el vector C-Brick: añadir 2 μl del vector linealizado (50 ng) de la etapa 3.1.4 y 6 μl del fragmento de ADN (200 ng) de la etapa 3.2.3 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 1 μl de tampón de ADN ligasa 10 x T4 y 1 μl de ADN ligasa T4. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C. </li><li> Añadir 10 μl de los productos de ligación (etapa 3.3.1) para la transformación química en células competentes de E. coli (DH10B). </li><li> Se agregan varios clones a un tubo LB líquido de 5 ml y se incuba durante la noche en un agitador a 220 rpm y 37ºC. </li><li> Extraer el plásmido usando un kit de preparación de plásmido; Siga el protocolo del fabricante. </li><li> Identificar los clones correctos mediante la secuenciación de Sanger 11 . </li></ol></li><li> Realice una nueva ronda de ensamblaje C-Brick. Los clones correctos de la etapa 3.3.4 pueden usarse como un nuevo vector de C-Brick o parte de ADN para un montaje iterativo de C-Brick adicional, siguiendo el mismo protocolo de los pasos 3.1-3.3. NOTA: T2 &#39;y T3&#39; sItes están diseñados como la copia de seguridad de los sitios T2 y T3 ( Figura 1a ). Para los plásmidos obtenidos de la etapa 2.3.7, sólo pueden utilizarse T2 &#39;y T3&#39; para el ensamblaje estándar de C-Brick. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un procedimiento para el ensamblaje de ADN estándar C-Brick. El paso más importante en este protocolo es la linealización del vector estándar de C-Brick; La escisión incompleta del vector podría afectar seriamente la tasa de éxito. Adicionalmente, aunque Cpf1 escinde principalmente secuencias de ADN diana en el patrón de escisión &quot;18-23&quot;, también se detectó una escisión imprecisa cerca de las dos bases 4 , lo que puede causar un pequeño número de mu...

La estandarización de las partes biológicas del ADN es importante para el desarrollo de la biología sintética 1 . El desarrollo de un procedimiento de ensamblaje de ADN puede reemplazar diseños experimentales ad hoc y eliminar muchos de los resultados inesperados que surgen durante el ensamblaje de componentes genéticos en sistemas más grandes. El estándar BioBrick (BBF RFC 10) fue uno de los primeros estándares de ensamblaje de ADN propuestos. Utiliza la secuencia de prefijo (que contiene sitios de corte EcoRI y XbaI) y la secuencia de sufijo (que contiene sitios de corte SpeI y PstI) 2 , 3 . Debido a que XbaI y SpeI tienen extremos cohesivos complementarios, las partes de ADN de BioBrick que se cortan con XbaI y SpeI se pueden unir, generando una nueva BioBrick para un montaje iterativo adicional. Algunos defectos han sido identificados con el uso del estándar BioBrick 4 . Por ejemplo, produce una cicatriz de 8 pbEntre las partes de ADN, que no permite la construcción de proteínas en fusión. Además, los cuatro tipos de sitios de restricción de 6 pb mencionados anteriormente deben retirarse de las partes de ADN, lo cual es muy inconveniente. El estándar BglBrick se estableció para resolver el primer problema 5 . Crea una cicatriz de 6 pb &quot;GGATCT&quot;, produciendo Gly-Ser y permitiendo la fusión de múltiples proteínas o dominios de proteínas. IBrick fue desarrollado para hacer frente al segundo problema 6 . Utiliza endonucleasas homing (HEs) que reconocen largas secuencias de ADN. Como los sitios de reconocimiento de HE rara vez existen en secuencias de ADN naturales, el estándar iBrick puede ser usado para la construcción directa de partes de iBrick sin modificar sus secuencias de ADN. Sin embargo, el estándar de iBrick deja una cicatriz de 21 pb entre las partes de ADN, lo que podría ser la razón de su impopularidad. En los últimos años, las repeticiones palindrómicas cortas intercaladas con intervalos regulares (CRISPR) se ha desarrollado rápidamente 7 , 8 . Entre las proteínas asociadas a CRISPR (Cas), la endonucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes es ahora ampliamente utilizada. En su mayor parte introduce introducciones de doble cadena de ADN (DSB) con extremos romos 9 . En 2015, Zhang y compañeros de trabajo caracterizaron Cpf1 (CRISPR de Prevotella y Francisella 1) por primera vez. Pertenece al sistema de tipo 2 CRISPR-Cas de tipo V y es una endonucleasa guiada por ARN de CRISRP (crRNA) 10 . A diferencia de Cas9, Cpf1 introduce un DSB con un 4 o 5 nt 5 &#39;sobresaliente 10 . Basándose en esta característica, Cpf1 se utilizó para desarrollar un estándar de ensamblaje de ADN, C-Brick 4 . En un vector estándar de C-Brick, cuatro sitios objetivo Cpf1 de T1 / T2 prefijados y T3 / T4 sufijados flanquean las partes biológicas; Esto es similar al estándar BioBrick. Como la escisión de los sitios T2 y T3 pProduce extremos pegajosos complementarios, es posible realizar el montaje iterativo de partes de ADN mientras se genera una cicatriz &quot;GGATCC&quot; entre las partes. Cabe destacar que el estándar C-Brick tiene dos ventajas principales: reconocer secuencias largas de blanco y dejar cicatrices cortas. La cicatriz de 6 pb &quot;GGATCC&quot; generada por C-Brick codifica Gly-Ser, que permite la construcción de proteínas de fusión. Además, el estándar C-Brick es también parcialmente compatible con los estándares BglBrick y BioBrick.

<table><tbody><tr><td>Comercial Oligonucleotide</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Taq PCR Buffer</td><td>Transgen</td><td>#J40928</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure Distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>5x RNA Transcription Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0441</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EP0111</td><td></td></tr><tr><td>NTP mixture</td><td>Sangon</td><td>#ND0056</td><td></td></tr><tr><td>RRI (Recombinant RNase Inhibitor)</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp;amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nano-Drop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>2x Phanta Max Buffer</td><td>Vazyme</td><td>PB505</td><td>PCR buffer</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Transgen</td><td>AD101</td><td></td></tr><tr><td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Vazyme</td><td>P505-d1</td><td></td></tr><tr><td>Ezmax for One-step Cloning</td><td>Tolobio</td><td>24303-1</td><td>seamless assembly kit</td></tr><tr><td>5x Buffer for Ezmax One-step Cloning</td><td>Tolobio</td><td>32006</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>#R0136L</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>#R3136L</td><td></td></tr><tr><td>BglII&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>#R0144L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>#R0145L</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>NEB</td><td>#R3133L</td><td></td></tr><tr><td>10x Buffer 3</td><td>NEB</td><td>#B7003S</td><td></td></tr><tr><td>10x CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligase Buffer</td><td>Tolobio</td><td>32002</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>Tolobio</td><td>32206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Tolobio</td><td>32210</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>#R01762</td><td></td></tr><tr><td>SV Gel and PCR clean-up system</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Mini Kit I</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>plasmid preparation kit</td></tr><tr><td>thermosensitive alkaline phosphatase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EF0651</td><td>FastAP</td></tr><tr><td>10x Cpf1 buffer</td><td>Tolobio</td><td>32008</td><td></td></tr><tr><td>Cpf1</td><td>Tolobio</td><td>32105</td><td>FnCpf1</td></tr><tr><td>thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>veriti 96 well</td><td></td></tr><tr><td>C-Brick standard vector</td><td>Tolobio</td><td>98101</td><td></td></tr><tr><td>E. coli [DH10B]</td><td>Invitrogen</td><td>18297010</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani media (tryptone)</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani media (yeast extract)</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani media (NaCl)</td><td>Sangon Biotech</td><td>B126BA0007</td><td></td></tr></tbody></table>

protocols for c-brick dna standard assembly using cpf1

La proteína Cpf1 asociada a CRISPR cliva ADN de doble cadena bajo la guía de ARN CRISPR (CRRNA), generando extremos pegajosos. Debido a esta característica, Cpf1 se ha utilizado para el establecimiento de un estándar de ensamblaje de ADN llamado C-Brick, que tiene la ventaja de sitios de reconocimiento largos y cicatrices cortas. En un vector estándar de C-Brick, hay cuatro sitios de reconocimiento Cpf1 - el prefijo (sitios T1 y T2) y el sufijo (sitios T3 y T4) - partes flanqueantes de ADN biológico. La escisión de los sitios T2 y T3 produce extremos pegajosos complementarios, que permiten el ensamblaje de partes de ADN con sitios T2 y T3. Mientras tanto, se genera una cicatriz corta &quot;GGATCC&quot; entre las piezas después del montaje. Como el plásmido recién formado contiene de nuevo los cuatro sitios de escisión de Cpf1, el método permite el ensamblaje iterativo de partes de ADN, que es similar a las de los patrones de BioBrick y BglBrick. Un procedimiento que describe el uso de la norma C-Brick para ensamblar partes de ADNSe describe aquí. El estándar de C-Brick puede ser ampliamente utilizado por científicos, estudiantes de posgrado y de pregrado, e incluso aficionados.

<html> Este protocolo demostró el ensamblaje de tres casetes de cromoproteína (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012), y amilGFP (BBa_K592010)). En primer lugar, las secuencias codificantes de los tres genes y terminadores mencionados anteriormente se clonaron individualmente en un vector estándar de C-Brick. Partes cortas de ADN, promotor y terminador, se introdujeron en el vector C-Brick mediante amplificación por PCR usando cebadores que contenían las partes cortas de ADN en ...

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Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

La proteína Cpf1 asociada con CRISPR puede ser guiada por un ARN CRISPR (crRNA) especialmente diseñado para escindir ADN de doble hebra en los sitios deseados, generando extremos pegajosos. Basándose en esta característica, se estableció un estándar de ensamblaje de ADN (C-Brick), y se describe aquí un protocolo que detalla su uso.

Protocolos para el ensamblaje estándar de ADN de C-Brick usando Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

8.2K vistas.  Chinese Academy of Sciences.  La proteína Cpf1 asociada con CRISPR puede ser guiada por un ARN CRISPR (crRNA) especialmente diseñado para escindir ADN de doble hebra en los sitios deseados, generando extremos pegajosos. Basándose en esta característica, se estableció un estándar de ensamblaje de ADN (C-Brick), y se describe aquí un protocolo que detalla su uso. 

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A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Un juego de herramientas para la conversión de hidrocarburos en ambientes acuosos

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Investigación

Bioingeniería

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic engineering became applicable to a large range of systems. Moreover, many transcriptional and epigenomic engineering approaches are now generally feasible for the first time. One reason for the broad applicability of CRISPR lies in its bipartite nature. Small gRNAs determine the genomic targets of the complex, variants of the protein Cas9, and the local molecular consequences. However, many CRISPR approaches depend on the simultaneous delivery of multiple gRNAs into individual cells. Here, we present a customizable protocol for string assembly gRNA cloning (STAgR), a method that allows the simple, fast and efficient generation of multiplexed gRNA expression vectors in a single cloning step. STAgR is cost-effective, since (in this protocol) the individual targeting sequences are introduced by short overhang primers while the long DNA templates of the gRNA expression cassettes can be re-used multiple times. Moreover, STAgR allows single step incorporation of a large number of gRNAs, as well as combinations of different gRNA variants, vectors and promoters.

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

Here, we present string assembly gRNA cloning (STAgR), a method to easily multiplex gRNA vectors for CRISPR/Cas9 approaches. STAgR makes gRNA multiplexing simple, efficient and customizable.

Un protocolo adaptable para cadena montaje gRNA clonación (fantasía STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Genética

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) is used to fix chromatin interactions. Then, chromatin digestion with a restriction enzyme and subsequent religation of fragment ends converts three-dimensional (3D) proximity into unique ligation products. Finally, after reversal of crosslinks, protein removal, and DNA isolation, DNA is sheared and prepared for high-throughput sequencing. The frequency of proximity ligation of pairs of loci is a measure of the frequency of their colocalization in three-dimensional space in a cell population.
A sequenced Hi-C library provides genome-wide information on interaction frequencies between all pairs of loci. The resolution and precision of Hi-C relies on efficient crosslinking that maintains chromatin contacts and frequent and uniform fragmentation of the chromatin. This paper describes an improved in situ Hi-C protocol, Hi-C 3.0, that increases the efficiency of crosslinking by combining two crosslinkers (formaldehyde [FA] and disuccinimidyl glutarate [DSG]), followed by finer digestion using two restriction enzymes (DpnII and DdeI). Hi-C 3.0 is a single protocol for the accurate quantification of genome folding features at smaller scales such as loops and topologically associating domains (TADs), as well as features at larger nucleus-wide scales such as compartments.

Hi-C 3.0 is an improved Hi-C protocol that combines formaldehyde and disuccinimidyl glutarate crosslinkers with a cocktail of DpnII and DdeI restriction enzymes to increase the signal-to-noise ratio and the resolution of chromatin interaction detection.

Captura de la conformación cromosómica a través de escalas de longitud

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

Motivos de ADN estable, 1D y 2D nanoestructuras construyen a partir de moléculas de ADN Circular pequeño

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Química

Captura de la conformación cromosómica (3C) para la investigación y la docencia de pregrado

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C techniques) that provide detailed information of the three-dimensional organization of chromatin. The 3C techniques have been used in a wide range of studies, from monitoring the changes in chromatin organization in cancer cells to identifying enhancer contacts made with gene promoters. While many of the studies using these techniques are asking big genome-wide questions with intricate sample types (i.e., single-cell analysis), what is often lost is that the 3C techniques are grounded in basic molecular biology methods that are applicable to a broad range of studies. By addressing tightly focused questions of chromatin organization, this cutting-edge technique can be used to enhance the undergraduate research and teaching lab experience. This paper presents a 3C protocol and provides adaptations and points of emphasis for implementation at primarily undergraduate institutions in undergraduate research and teaching experiences.

Autor destacado: Obtener una A con las 3C: Captura de la conformación cromosómica para estudiantes universitarios  

Here, we present an adaption of the chromosome conformation capture (3C) technique in detail with an emphasis on undergraduate involvement and learning.

Obtener una A con las 3C: Captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m resolution, show great potential in various fields of nanotechnology such as the molecular reactors, drug delivery, and nanoplasmonic systems. The reconfigurable DNA accordion rack, which can collectively manipulate a 2D or 3D nanoscale network of elements, in multiple stages in response to the DNA inputs, is described. The platform has potential to increase the number of elements that DNA nanomachines can control from a few elements to a network scale with multiple stages of reconfiguration.
In this protocol, we describe the entire experimental process of the reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes. The protocol includes a design rule and simulation procedure of the structures and a wet-lab experiment for synthesis and reconfiguration. In addition, analysis of the structure using TEM (transmission electron microscopy) and FRET (fluorescence resonance energy transfer) is included in the protocol. The novel design and simulation methods covered in this protocol will assist researchers to use the DNA accordion rack for further applications.

We describe the detailed protocol for design, simulation, wet-lab experiments, and analysis for a reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes.

Diseño y síntesis de un ADN Reconfigurable acordeón Rack

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that cut outside of their recognition sites and create a short overhang. This modular cloning (MoClo) system uses a hierarchical workflow in which different DNA parts, such as promoters, coding sequences (CDS), and terminators, are first cloned into an entry vector. Multiple entry vectors then assemble into transcription units. Several transcription units then connect into a multi-gene plasmid. The Golden Gate cloning strategy is of tremendous advantage because it allows scar-less, directional, and modular assembly in a one-pot reaction. The hierarchical workflow typically enables the facile cloning of a large variety of multi-gene constructs with no need for sequencing beyond entry vectors. The use of fluorescent protein dropouts enables easy visual screening. This work provides a detailed, step-by-step protocol for assembling multi-gene plasmids using the yeast modular cloning (MoClo) kit. We show optimal and suboptimal results of multi-gene plasmid assembly and provide a guide for screening for colonies. This cloning strategy is highly applicable for yeast metabolic engineering and other situations in which multi-gene plasmid cloning is required.

The goal of this protocol is to provide a detailed, step-by-step guide for assembling multi-gene constructs using the modular cloning system based on Golden Gate cloning. It also gives recommendations on critical steps to ensure optimal assembly based on our experiences.

Montaje rápido de construcciones multigénicas mediante clonación modular Golden Gate

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a genetic model organism for human-disease related research. Recent years have seen technical advancements like homologous recombination and recombineering. However, generating unequivocal null mutations or tagging endogenous proteins remains a substantial effort for most genes. Here, we describe and demonstrate techniques for using recombineering-based cloning methods to generate vectors that can be used to target and manipulate endogenous loci in vivo. Specifically, we have established a combination of three technologies: (1) BAC transgenesis/recombineering, (2) ends-out homologous recombination and (3) Gateway technology to provide a robust, efficient and flexible method for manipulating endogenous genomic loci. In this protocol, we provide step-by-step details about how to (1) design individual vectors, (2) how to clone large fragments of genomic DNA into the homologous recombination vector using gap repair, and (3) how to replace or tag genes of interest within these vectors using a second round of recombineering. Finally, we will also provide a protocol for how to mobilize these cassettes in vivo to generate a knockout, or a tagged gene via knock-in. These methods can easily be adopted for multiple targets in parallel and provide a means for manipulating the Drosophila genome in a timely and efficient manner.

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homologous recombination techniques greatly advance Drosophila genetics by enabling the creation of molecularly precise mutations. The recent adoption of recombineering allows one to manipulate large pieces of DNA and transform them into Drosophila6. The methods presented here combine these techniques to rapidly generate large homologous recombination vectors.

Recombinería homólogos Construcciones recombinación en<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

Protocolos para el ensamblaje estándar de ADN de C-Brick usando Cpf1

Resumen

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Obtener una A con las 3C: Captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios

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Recombinería homólogos Construcciones recombinación en