Questo metodo per la dissezione e l'immunofluorescenza è utilizzato da molti laboratori di C.elegans. Può essere adottato per rilevare qualsiasi proteina per cui è disponibile un anticorpo o una proteina di fusione marcata. Sebbene richieda un po 'di pratica per ottenere questa dissezione giusta, questo protocollo è flessibile e diretto da risolvere.
Per noi, la colorazione DAPI funziona sempre e di solito possiamo trovare una condizione che funzioni per ogni anticorpo. La sfida più grande per questa tecnica è la fase di dissezione. Devi lavorare rapidamente ma con fiducia per ottenere buoni estrusi germinali.
La pratica è fondamentale. Per iniziare, posizionare un vetrino di tenuta sul palco di un microscopio da dissezione e posizionare il coprivetrino sopra il vetrino di attesa. Quindi, pipettare quattro microlitri della soluzione di dissezione al centro del vetrino di copertura e spostare la diapositiva di tenuta su un lato del palco per liberare la vista.
Scegli da 10 a 20 ermafroditi da una piastra NGM nella goccia di soluzione dissecante. È meglio sceglierne circa 10 per diapositiva, ma non così tanti da non poter essere sezionati entro cinque minuti. Per sezionare gli animali, incrocia le punte degli aghi per creare una forma a X e usa il fondo della X per appuntare un adulto sulla superficie della vetrina.
Quindi, posiziona la forma a X immediatamente dietro la faringe, circa un quinto della lunghezza del corpo di un giovane adulto o appena sotto la parte chiara della testa. Quindi, decapitare l'animale con un movimento a forbice, rilasciando completamente dalla cavità del corpo, insieme a una o entrambe le metà dell'intestino. Per fissare il campione con formaldeide, pipettare quattro microlitri della soluzione fissa sul vetrino, molto vicino alla goccia con gli animali, evitando di pipettare direttamente nella goccia di dissezione e spostando le carcasse sezionate.
Appuntare il coprislip sul vetrino di tenuta usando un dito. Con l'altra mano, sfiorare delicatamente il copricopertina un paio di volte per mescolare le gocce. Tenendo una slitta caricata positivamente con il lato anteriore rivolto verso il basso, utilizzarla per raccogliere la vetrina al centro della diapositiva toccando delicatamente la goccia del campione e la tensione superficiale della goccia raccoglierà la vetrina.
Posizionare lo scivolo sulla panca e fissare per esattamente cinque minuti a temperatura ambiente. Durante questo periodo, etichettare la diapositiva con una matita. Per congelare il campione usando azoto liquido tenendo il bordo etichettato del vetrino con una pinzetta, abbassarlo delicatamente in azoto liquido.
Rilasciare il vetrino, in modo che si appoggi al lato del becher con il coperchio rivolto verso l'alto, e le guide vengano congelate entro 10 secondi. Se si utilizza ghiaccio secco per congelare, dopo aver raschiato la brina dalla superficie del blocco di alluminio con un rasoio, tenere saldamente il bordo etichettato del vetrino e posizionarlo sulla superficie libera, applicando una certa pressione verso il basso per garantire il pieno contatto con il blocco. Il congelamento avviene entro 10 secondi quando il campione sotto il coprislip si trasforma in ghiaccio.
Rimuovere la diapositiva congelata afferrando saldamente il bordo corto etichettato della diapositiva e appoggiare un bordo lungo contro la panca. Con l'altra mano, afferrare saldamente un rasoio e far scorrere il bordo del rasoio lungo il vetrino per far scorrere il coperchio via dal campione. Posizionare immediatamente il vetrino in un barattolo Coplin contenente il 95% di etanolo e lasciare i vetrini in etanolo per almeno cinque minuti.
Quindi, lavare i vetrini in PBST tre volte per cinque minuti ciascuno a temperatura ambiente, utilizzando PBST fresco per ogni lavaggio. I risultati dell'imaging a fluorescenza dei nuclei germinali hanno dimostrato che il DAPI si lega fortemente al DNA. La colorazione con immunofluorescenza è stata efficace quando l'anticorpo che ha come bersaglio RAD-51, un marker per le rotture a doppio filamento, era presente come focolai discreti all'interno dei nuclei miotici, co-localizzati sui cromosomi marcati da DAPI.
I mutanti eterozigoti kle-2 hanno difetti minori nella struttura cromosomica, come dimostrato dalla colorazione DAPI leggermente disordinata e da un aumento del numero di rottura del doppio filamento, riflesso nel maggior numero di focolai di RAD-51. Sia la dissezione che il congelamento delle fessure possono essere complicati, quindi è importante lavorare rapidamente e senza intoppi. Si consiglia di praticare questi passaggi prima di tentare l'intero protocollo.
Ad esempio, potresti esercitarti a sezionare in un volume maggiore di liquido, come 200 microlitri, e gradualmente lavorare fino al nostro volume consigliato di quattro microlitri in un vetrino di copertura. Questa tecnica può essere utilizzata per l'imaging ad alta risoluzione su un microscopio a illuminazione confocale o strutturata, oppure può essere utilizzata in combinazione con DNA o RNA-FISH, ibridazione fluorescenza in situ, per visualizzare come le proteine si localizzano in relazione a sequenze specifiche.
