解剖および免疫蛍光のためのこの方法は、多くのC.elegansラボで使用されています。抗体またはタグ付き融合タンパク質が利用可能な任意のタンパク質を検出するために採用することができる。この解剖を正しく行うにはある程度の練習が必要ですが、このプロトコルは柔軟でトラブルシューティングが簡単です。
私たちにとって、DAPI染色は常に機能し、通常、各抗体に有効な条件を見つけることができます。この技術の最大の課題は、解剖ステップです。あなたは良い生殖細胞系列の押し出しを得るために迅速にしかし自信を持って働かなければなりません。
練習が鍵です。まず、解剖顕微鏡のステージに保持スライドを置き、保持スライドの上にカバーガラスを置きます。次に、4マイクロリットルの解剖液をカバーガラスの中央にピペットで入れ、保持スライドをステージの片側に移動してビューを解放します。
NGMプレートから10〜20個の雌雄同体を解剖液の滴に選びます。スライドごとに約10個を選択するのが最善ですが、5分以内に解剖できないほど多くはありません。動物を解剖するには、針の先端を交差させてX字型を作り、Xの底を使用して大人をカバーガラスの表面に固定します。
次に、X字型を咽頭のすぐ後ろ、若年成人の体長の約5分の1、または頭の透明な部分のすぐ下に配置します。次に、1回のはさみ運動で動物を斬首し、腸の片方または両方の半分とともに体腔から完全に解放します。サンプルをホルムアルデヒドで固定するには、動物と一緒にドロップに非常に近いカバーガラスに4マイクロリットルの固定溶液をピペットで固定し、解剖ドロップに直接ピペットで入れないようにし、解剖した死体を移動させます。
1本の指でカバーガラスを保持スライドに固定します。もう一方の手で、カバーガラスを数回そっとフリックして、滴を混ぜます。正に帯電したスライドを前面に下にして持ち、サンプルドロップにそっと触れてスライドの中央にあるカバーガラスを拾うと、ドロップの表面張力がカバーガラスを拾います。
スライドをベンチに置き、室温で正確に5分間固定します。この間、スライドに鉛筆でラベルを付けます。スライドのラベル付きエッジをピンセットで保持しながら、液体窒素を使用してサンプルを凍結クラックするには、液体窒素にそっと下げます。
カバーガラス面を上にしてビーカーの側面に寄りかかるようにスライドを放し、スライドは10秒以内に凍結します。ドライアイスを使用して凍結する場合は、かみそりでアルミニウムブロックの表面から霜をこすり落とした後、スライドのラベルの付いた端をしっかりと保持し、クリアな表面に置き、下向きに圧力を加えてブロックと完全に接触するようにします。カバーガラスの下のサンプルが氷に変わると、凍結は10秒以内に発生します。
スライドのラベルの付いた短い端をしっかりとつかんで凍結したスライドを取り除き、片方の長い端をベンチに固定します。もう一方の手で、かみそりをしっかりと握り、かみそりの端をスライドの下にスライドさせて、カバーガラスをはじいてサンプルから離します。すぐにスライドを95%エタノールを含むCoplinジャーに入れ、スライドをエタノールに少なくとも5分間放置します。
次に、スライドをPBSTで3回、室温でそれぞれ5分間洗浄し、洗浄ごとに新しいPBSTを使用します。生殖細胞核の蛍光イメージング結果は、DAPIがDNAに強く結合することを示しました。免疫蛍光染色は、二本鎖切断のマーカーであるRAD-51を標的とする抗体が、DAPIでマークされた染色体上に共局在する縮瞳核内の個別の病巣として存在する場合に有効でした。
kle-2ヘテロ接合体変異体は、わずかに無秩序なDAPI染色および二本鎖切断数の増加によって示されるように、染色体構造に軽微な欠陥を有し、RAD-51病巣の数の増加に反映される。解剖と凍結亀裂の両方のステップは難しい場合があるため、迅速かつスムーズに作業することが重要です。プロトコル全体を試す前に、これらの手順を練習することをお勧めします。
たとえば、200マイクロリットルなどの大量の液体で解剖し、カバースリップで推奨される4マイクロリットルまで徐々に作業する練習をすることができます。この手法は、共焦点または構造化照明顕微鏡での高解像度イメージングに使用したり、DNAまたはRNA-FISHと組み合わせて蛍光in situハイブリダイゼーションを使用して、特定の配列に関連してタンパク質がどのように局在するかを視覚化することができます。
