Los canales iónicos no son estáticos en las membranas biológicas. Aquí presentamos un enfoque óptico de una sola molécula para desentrañar el vínculo entre la difusión de la membrana lateral y la función del canal iónico. La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos es que no se requiere el marcado fluorescente de proteínas que podrían interferir con su movimiento lateral y función.
El método se puede aplicar a cualquier canal de proteína de membrana donde la difusión libre o restringida es importante para la organización y la función. Para comenzar, transfiera 380 microlitros de la solución madre de DPhPC a un vial de vidrio y cubra la solución de reserva de lípidos con argón o gas nitrógeno para evitar la oxidación de lípidos. Utilice el flujo de gas más bajo posible para evitar la evaporación del disolvente orgánico en el que se disuelven los lípidos, o salpicaduras de los aerosoles de disolvente del vial.
Seque la muestra de lípidos bajo una corriente de nitrógeno y retire el disolvente orgánico restante de la muestra de lípidos al vacío utilizando una bomba de vacío exenta de aceite durante la noche. Disuelva la película lipídica en una solución de aceite de silicona hexadecano agregando volúmenes iguales de hexadecano y aceite de silicona usando una pipeta de un mililitro a una concentración lipídica final de 9.5 miligramos por mililitro. Coloque algunos cubreobjetos de vidrio en un soporte de cubreobjetos de acero inoxidable y límpielos en un vaso de precipitados de vidrio durante unos 10 minutos con acetona en un limpiador ultrasónico.
Enjuague los cubreobjetos con agua desionizada doble y séquelos bajo una corriente de nitrógeno. Además, limpie e hidrofilice un cubreobjetos en un limpiador de plasma con oxígeno durante cinco minutos. Monte un cubreobjetos tratados con plasma en una recubridora de centrifugado y cubra el cubreobjetos con una película de espesor submicrométrico de agarosa agregando lentamente 140 microlitros de agarosa calentada al 0,75% de bajo punto de fusión con una pipeta de 200 microlitros a 3.000 RPM durante 30 segundos.
Fije inmediatamente el cubreobjetos recubierto de centrifugado con la capa delgada del hidrogel de agarosa a la parte inferior de la cámara de PMMA. Asegúrese de que el hidrogel de agarosa apunte hacia arriba. Fije los bordes del cubreobjetos al dispositivo micromecanizado de PMMA con cinta adhesiva transparente y coloque el dispositivo en una placa caliente calentada a 35 grados centígrados.
Vierta cuidadosamente 200 microlitros de solución de agarosa al 2,5% en la entrada de la cámara sin crear burbujas de aire. Cubra inmediatamente los pocillos de la cámara de PMMA con alrededor de 60 microlitros de la solución de aceite lipídico para iniciar la formación de monocapa lipídica en la interfaz del aceite de agarosa para evitar la deshidratación de la agarosa recubierta de espín en los pocillos de la cámara de PMMA. Coloque el dispositivo en una placa caliente a 35 grados centígrados durante aproximadamente dos horas.
Coloque alrededor de 20 microlitros de solución de aceite de silicona hexadecano lipídico en cada uno de los varios pocillos microfabricados en una cámara de incubación de gotas. Prepare una aguja de vidrio microcapilar con un diámetro de abertura de punta de alrededor de 20 micrómetros utilizando un extractor de micropipetas vertical u horizontal. Llene la aguja con alrededor de cinco microlitros de solución inyectable acuosa que contenga 8,8 milimolares de HEPES, siete micromolares de un colorante fluorescente, Fluo-8, 400 EDTA micromolares, 1,32 cloruro de potasio molar y 30 nanomolares TOM core complex o, alternativamente, 20 nanomolares OMPF.
Monte la aguja con la solución de inyección acuosa en un nanoinyector piezoaccionado e inyecte de 100 a 200 nanolitros de gotitas acuosas en los pocillos de la cámara de incubación de gotas llena de solución de aceite de silicona hexadecano lipídico utilizando el nanoinyector. Permita la formación de una monocapa lipídica en la interfaz del aceite de gotas durante aproximadamente dos horas manteniendo las cámaras de incubación de PMMA y gotas en una placa caliente calentada a 35 grados centígrados. Transfiera manualmente gotitas acuosas individuales desde los pocillos de la cámara de incubación de gotas a los pocillos de la cámara de PMMA utilizando una pipeta de microlitro de un solo canal con una punta de polipropileno desechable de 10 microlitros.
Permita que las gotitas se hundan en las monocapas lipídicas en las interfaces hidrogel-aceite para formar una bicapa lipídica entre las gotitas y el hidrogel de agarosa. Monte la cámara de PMMA con la bicapa de interfaz de gotas o membranas DIB en el soporte de muestra de un microscopio de luz invertida, y evalúe la formación de la membrana utilizando un objetivo de contraste de modulación Hoffman 10x. Si se han formado membranas DIB, monte la cámara de PMMA en el portamuestras de un microscopio TIRF equipado con una fuente de luz convencional para la iluminación de epifluorescencia, un láser de 488 nanómetros y una cámara CCD multiplicadora de electrones retroiluminada para lograr un tamaño de píxel de alrededor de 0,16 micrómetros.
Enfoque el borde de una membrana DIB con un objetivo de aumento de 10x bajo iluminación de epifluorescencia con una fuente de luz de alta intensidad utilizando un conjunto de filtros GFP. Enfoque fino del mismo borde de la membrana DIB a gran aumento con un objetivo TIRF de aceite apocromático 100x NA 1.49, nuevamente bajo iluminación de epifluorescencia con una fuente de luz de alta intensidad utilizando un conjunto de filtros GFP. Cambie la configuración del filtro de GFP al conjunto de filtros TIRF de banda cuádruple, encienda el láser de 488 nanómetros y establezca la intensidad del láser en la lente del objetivo.
Para visualizar canales iónicos individuales, ajuste el ángulo TIRF y la ganancia de la cámara CCD EM para que los canales iónicos abiertos en la membrana DIB aparezcan como puntos fluorescentes de alto contraste sobre un fondo oscuro, y la relación señal/fondo alcance un máximo. Asegúrese de que los puntos correspondientes al flujo de iones de calcio a través de canales iónicos individuales permanezcan enfocados y tengan una forma redonda con alta intensidad en el centro y disminuyendo gradualmente hacia la periferia. Compruebe que los puntos fluorescentes están enfocados para asegurarse de que los canales iónicos se han reconstituido en las membranas DIB y se mueven lateralmente en el plano de la membrana.
Finalmente, registre una serie de imágenes de membrana que permitan un seguimiento adecuado de la posición y el monitoreo del estado abierto-cerrado de los canales iónicos individuales. Para determinar el tipo de movilidad lateral y el estado de actividad del canal, adquirir trayectorias suficientemente largas y bien muestreadas. La estructura crioEM de Neurospora crassa TOM-CC se muestra aquí.
Las mitocondrias de una tinción de N.crassa que contenía un TOM 22 con una etiqueta 6-His se solubilizaron en DDM y se sometieron a cromatografía de afinidad NTA de níquel y cromatografía de intercambio aniónico. SDS-PAGE de la estructura cristalina aislada de TOM-CC y SDS-PAGE de E. coli OMPF purificada utilizada para la comparación se muestran aquí. La traza de amplitud fluorescente en la trayectoria correspondiente de TOM-CC indica que la actividad del canal abierto-cerrado de TOM-CC se correlaciona con la movilidad de la membrana lateral del complejo.
La traza de amplitud muestra tres estados de permeabilidad: estado completamente abierto correspondiente a canales móviles, estado de permeabilidad intermedio y estado de canal cerrado correspondiente a canales no móviles. TOM-CC en el estado intermedio se tambalea alrededor de su posición media en aproximadamente más/menos 60 nanómetros. La traza de amplitud fluorescente en la trayectoria correspondiente de OMPF se muestra aquí.
OMPF revela solo un nivel de intensidad en comparación con TOM-CC, independientemente de si está en movimiento o atrapado. Los segmentos de trayectoria correspondientes a los períodos de tiempo de las moléculas atrapadas están marcados en gris. Una cosa importante a tener en cuenta es que este método analiza proteínas de membrana única en un entorno de membrana intacto.
La dinámica de las proteínas de membrana seguirá siendo un horizonte para los estudios científicos en el futuro previsible. Esperamos que nuestro método contribuya significativamente a este campo.
