Transducir timocitos inmaduros con vectores retrovirales y cultivar estas células en células estromales OP9 DL4 es una técnica desafiante. Este protocolo detallado ahorrará tiempo y esfuerzo a los investigadores mientras optimiza estos sistemas. Esta técnica proporciona un sistema in vitro flexible para estudiar los efectos de las modificaciones genéticas en las células T inmaduras y puede ser útil para estudiar el desarrollo de las células T y el cáncer.
Demostrando el procedimiento estará Gisele Rodrigues, becaria postdoctoral de mi laboratorio. Para comenzar, siembre las células productoras de retrovirus de 18 a 24 horas antes de la transfección al 70 a 90% de confluencia en cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de seis pocillos que contenga dos mililitros de célula productora de retrovirus, o medio RPC. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Para transfectar las células, reemplace el medio con medio RPC fresco una hora antes de la transfección. Preparar mezclas de lipofección diluyendo cuatro microgramos de ADN que contengan dos microgramos de plásmido auxiliar pCL-Eco y dos microgramos de plásmido de transferencia pMIG en 250 microlitros de medio sérico reducido y mezclar suavemente. A continuación, mezcle 10 microlitros de reactivo de transfección y 250 microlitros de medio sérico reducido e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Después de cinco minutos de incubación, combine el ADN diluido con el reactivo de transfección diluido. Mezclar suavemente e incubar durante 20 a 25 minutos a temperatura ambiente. Agregue los 500 microlitros de la mezcla de ADN y reactivo de transfección suavemente al pocillo que contiene las células productoras de retrovirus dejándolas caer sobre las células con un movimiento circular.
Mezcle suavemente balanceando el plato hacia adelante y hacia atrás y luego incube el plato en una incubadora de 37 grados centígrados durante 16 a 24 horas. Aproximadamente 16 horas después de la transfección, reemplace el medio viejo con dos mililitros de medio RPC fresco y continúe incubando las células a 37 grados centígrados durante 20 a 24 horas. Para preparar la suspensión unicelular de timocitos, coloque un timo cosechado de ratones sacrificados en cinco mililitros de PBS en una placa de Petri.
Usando portaobjetos de vidrio estéril, coloque el timo entre las superficies esmeriladas de los portaobjetos y frote suavemente los portaobjetos juntos, enrollando el timo entre los dos portaobjetos. Enjuague los portaobjetos de vidrio para recoger las células y deseche el tejido estromal tímico remanente. Filtrar cinco mililitros de la suspensión tímica a través de un filtro filtrador de células de 30 o 40 micrómetros y centrifugar las células a 300 G durante 10 minutos.
Después de retirar el sobrenadante, lisar los glóbulos rojos agregando un mililitro de un tampón de lisis ACK por tubo durante un minuto. Agregue cinco mililitros de tampón de agotamiento celular para desactivar el tampón de lisis ACK, centrifugar la suspensión a 300 G durante 10 minutos y volver a suspender en uno a cinco mililitros de tampón de agotamiento celular para contar. Después de contar las células y centrifugar a 300 G durante 10 minutos, resuspender las células de una vez de 10 a la séptima en 80 microlitros de tampón de agotamiento celular.
Agregue 10 microlitros de microperlas CD4 y CD8 por una vez 10 a la séptima celda. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos en la oscuridad en el refrigerador. A continuación, prepare una columna de agotamiento enjuagándola con dos mililitros de tampón de agotamiento y desechando el flujo.
Lave las células incubadas agregando de uno a dos mililitros de tampón de agotamiento por una vez 10 o siete células. Centrifugar a 300 G durante 10 minutos y desechar el sobrenadante. Luego, aplique la suspensión de celda resuspendida a la columna y recoja el flujo de celdas no etiquetadas.
Lave la columna dos veces con un mililitro de tampón y recoja el flujo. Manchar los controles de eficiencia de agotamiento dividiendo los 200 microlitros de células recolectadas antes del agotamiento en cuatro tubos FACS, sin teñir, CD4 con tinción simple, CD8 con tinción simple y CD4 y CD8 con doble tinción. Utilice las muestras no teñidas y de una sola tinción para configurar los parámetros de citometría de flujo.
Use los 1, 000 microlitros de células recolectadas después del agotamiento para teñir CD4 y CD8 y compare con la muestra de doble tinción recolectada antes del agotamiento. Para cultivar los timocitos, colocar de dos a cinco veces de 10 a la quinta a una vez de 10 a la sexta timocitos después de la depleción en un matraz T25 de 80 a 90% de células OP9 DL4 confluentes en medio OP9 que contenga citocinas. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas en células OP9 DL4.
Para cosechar el retrovirus, recoja el sobrenadante que contiene los retrovirus de las células transectadas inclinando la placa de seis pocillos y luego colocando una jeringa de tres a cinco mililitros en la parte inferior de la placa mientras tira del émbolo para aspirar el sobrenadante. Filtre el sobrenadante de retrovirus a través de un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros y recoja el filtrado en un tubo de 50 mililitros. Reemplace el medio con dos mililitros de medio RPC fresco y continúe incubando las células a 37 grados centígrados durante 20 a 24 horas para la segunda transducción.
recoger los timocitos del cultivo OP9 DL4 mediante un pipeteo agresivo para eliminar los timocitos y las células OP9 DL4 de la superficie del matraz. Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 micrómetros para eliminar la mayoría de las células OP9 DL4 y recolecte el filtrado en un tubo de 50 mililitros. Centrifugar los timocitos y el filtrado a 300 G durante cinco minutos y desechar el sobrenadante.
Resuspender los timocitos en 0,5 a un mililitro de medio OP9 con citocinas. Agregue de uno a dos mililitros de medio RPC que contenga el virus. Luego, agregue bromuro de hexametrina a ocho microgramos por mililitro de suspensión celular total.
Espinocular el contenido centrifugando las células a 850 G durante una hora a temperatura ambiente. Resuspender las células en seis mililitros de medio OP9 con citoquinas por matraz y añadir la suspensión de nuevo a la monocapa de células OP9 DL4. Incubar a 37 grados centígrados durante la noche.
Repita los pasos de la recolección de retrovirus utilizando un nuevo pocillo del sobrenadante celular que contiene retrovirus. Mantener los timocitos transducidos en cultivo OP9 DL4 durante dos a cinco días o congelar según sea necesario. La eficiencia del agotamiento se evaluó citométricamente mediante el marcado de la fracción celular magnéticamente no marcada para CD4 y CD8 después de la separación celular inmunomagnética y el análisis de esto en un diagrama de puntos bivariante bidimensional.
Un buen rendimiento de células doble negativas para CD4 y CD8 es del 95% o superior, como se representa aquí. Cuando se utilizan vectores que expresan marcadores cribables, como un gen de fluorescencia, la transección y la transducción se pueden evaluar de manera aproximada y empírica mediante microscopía de fluorescencia. La eficiencia de la transducción se analizó mediante la recolección de los timocitos de la monocapa OP9 DL4.
y observar la expresión de un gen de fluorescencia mediante citometría de flujo. La eficiencia de la transducción utilizando un vector retroviral vacío con GFP como gen informador fue del 84,2% La diferenciación de células T en las células OP9 DL4 se observó cuatro días después de la transducción. Análisis de citometría de flujo de la diferenciación celular inducida por el cocultivo en células OP9 DL4 y la expresión transgénica, donde las células fueron marcadas para CD4, CD8, CD44 y CD 25.
La transducción de timocitos doble negativos con el vector retroviral vacío pMIG presentó aproximadamente las mismas proporciones de positivos simples, positivos dobles, dobles negativos, y sus subetapas doble negativo uno a cuatro que los timocitos no transducidos, lo que indica que el desarrollo de células T no se vio afectado por el proceso de transducción. La tarea más difícil al intentar replicar este protocolo es asegurarse de que los diferentes tipos de células se gestionan simultáneamente de forma coordinada. La sobreexpresión de oncogenes en timocitos inmaduros ocasionalmente puede afectar el desarrollo normal de las células T, por lo que el inmunofenotipado posterior por citometría de flujo es una forma útil de aprender qué dirección tomar.
El potencial oncogénico de las células T transducidas diferenciadas en las células de la capa fetal se puede investigar más a fondo mediante inyección en ratones inmunocomprometidos.
