Si bien las técnicas para evaluar los biomarcadores bioquímicos se utilizan ampliamente, este protocolo presenta detalles cruciales para estandarizar y replicar la metodología en anuros neotropicales. La principal ventaja de esta técnica es su bajo costo, replicabilidad y su aplicación. Esta técnica se puede aplicar para obtener datos cuantitativos para evaluar alteraciones en la melanina interna.
El ensayo cometa es una técnica sensible, versátil y sencilla que permite determinar los efectos genotóxicos inducidos por un compuesto específico. Se puede aplicar a cualquier tipo de células eucariotas para monitorear el daño del ADN, reparar el ADN y evaluar el estado antioxidante de las células. Para comenzar, abra el software Image-Pro Plus 6.0 y seleccione menú y barra de herramientas como biológico.
Para cuantificar el área ocupada por la melanina, seleccione medir y, a continuación, seleccione la calibración espacial de la ampliación utilizada para tomar las fotomicrografías. Después de abrir la imagen histológica, seleccione el recuento de herramientas y, a continuación, mida los objetos. Marque el color que se medirá en la imagen con la herramienta seleccionar colores y cuentagotas y, a continuación, cierre la ventana.
Visualice los resultados haciendo clic en recuento, vista y estadísticas. Incubar una mezcla de PBS, peróxido de hidrógeno y una muestra en una cubeta de cuarzo de tres mililitros con una longitud de paso de un centímetro. A continuación, retire la muestra guardada en un tubo de centrífuga de 500 microlitros y añádala a la cubeta de cuarzo.
Lea la cinética de la catalasa a 240 nanómetros durante dos minutos en un espectrofotómetro UV y calcule la actividad enzimática utilizando la ecuación que se muestra en la pantalla. Diluir la muestra de sangre recolectada con un mililitro de PBS. Centrifugar a 381 G durante nueve minutos y volver a suspender el pellet con 50 mililitros de PBS.
Mezcle 30 microlitros de la muestra de sangre en 70 microlitros de agarosa de bajo punto de fusión o LMPA a una concentración del 0,5% de agarosa para formar la capa dos. Coloque 50 microlitros de la capa dos en un portaobjetos previamente recubierto con la capa uno que contenga 100 microlitros de agarosa al 0,5% de punto de fusión normal. Cubra el portaobjetos con un cubreobjetos y colóquelo en el frío a cuatro grados centígrados durante 10 minutos para solidificar la capa dos.
Después de la solidificación, retire el cubreobjetos. Forme la tercera capa colocando 100 microlitros de 0,5%LMPA y vuelva a cubrir el portaobjetos. Después de que la tercera capa se solidifique, retire el cubreobjetos y sumerja cada portaobjetos en un frasco de coplin de 100 mililitros que contenga la solución de lisis preparada el mismo día.
Coloque los frascos de coplin en un baño frío a cuatro grados centígrados durante una hora en la oscuridad para que se produzca la lisis. Al final de la lisis, retire los portaobjetos y sumérjalos en la solución tampón de electroforesis en el tanque de electroforesis durante 15 minutos a cuatro grados centígrados para permitir que el ADN se desenrolle. Después de desenrollar el ADN nuclear, realice la electroforesis en el mismo tampón a cuatro grados Celsius durante 10 minutos a 25 voltios y 250 miliamperios.
Al final de la electroforesis, neutralice las muestras en los portaobjetos agregando dos mililitros de solución triclorhídrica tres veces durante cinco minutos. Coloque las muestras en frascos de coplin de 100 mililitros que contengan 95% de alcohol a cuatro grados centígrados para deshidratar las muestras. Tiñe las muestras añadiendo 10 microlitros de DAPI en el centro del portaobjetos.
A continuación, esparce el tinte por todas las muestras con un cubreobjetos. Examine los portaobjetos bajo un fotomicroscopio de fluorescencia con un filtro NU. Cuantificar el daño en el ADN evaluando la longitud de la migración del ADN desde el nucleoide.
En este caso, determinelo visualmente en 100 celdas seleccionadas al azar sin superposición. A continuación, clasifique el daño del ADN en cuatro clases, donde cero a uno es para ningún daño, dos es para el daño mínimo, tres es para el daño medio y cuatro es para el daño máximo. Exprese los datos como el número medio de células dañadas y la puntuación media del cometa para cada grupo de tratamiento.
Finalmente, a partir de estos datos, calcule el índice de daño genético o GDI para cada organismo de prueba utilizando la ecuación que se muestra en la pantalla. En esta figura se muestra el índice de masa escalonado de los adultos de Boana pulchella y Leptodactylus luctator. Para el análisis del índice de masa escalado, se realizó un análisis de regresión no lineal que demuestra la relación de la función de potencia entre el SVL y la masa corporal de la especie para determinar el exponente de escala.
El índice de masa escalonado es útil para comparar grupos de adultos o juveniles de la misma especie. Aquí se presentan los cortes histológicos del hígado de Boana raniceps. A partir de estas secciones se puede observar una mayor cantidad de c y mayores dimensiones del hepatocito y del núcleo de los hepatocitos.
En esta figura se muestran respuestas diferentes y complementarias de biomarcadores citogenéticos en un escenario de exposición a herbicidas en Boana pulchella. Aquí, las barras negras indican 48 horas y las barras grises indican 96 horas. El tiempo de exposición y la concentración siempre deben considerarse como un factor aquí, ya que un tiempo o concentración en particular puede no ser suficiente para inducir daño.
La imagen representativa describe cómo se relacionan los biomarcadores con el índice de respuesta del biomarcador. Aquí, el azul indica el grupo de control, mientras que los colores naranja, amarillo y verde indican los escenarios de exposición al BDE 209. Estos datos indican que la catalasa es un biomarcador eficaz para situaciones de estrés en las que el estresor está presente en las concentraciones más altas.
Al calcular el índice de condición corporal, tome fotografías de manera constante desde la misma distancia. En renacuajos, mida la longitud del cuerpo SVL hasta el tubo cloacal, excluyendo la aleta del collar. Este enfoque aborda de manera segura la fisiología de los anfibios y el impacto de los cambios ambientales.
Si bien existen biomarcadores alternativos potencialmente invasivos, estos métodos ofrecen información sobre el estrés oxidativo, la toxicodinámica y la toxicogenética. Las mediciones enzimáticas adicionales relacionadas con el estrés oxidativo pueden servir como metodologías alternativas. La técnica de análisis de diferencia de color evalúa las respuestas de los tejidos en fotomicrografías en función de las disparidades de color.
Para el sistema pigmentario, asegúrese de que la calibración del programa esté alineada con la fotomicrografía. Esta técnica avanzada es fundamental para investigar si los xenobióticos afectan directamente al ADN en diversos tipos de células, abordando cuestiones relacionadas con el daño oxidativo del material genético y los procesos de reparación que otras técnicas citogenéticas no pueden abordar.
