Presentamos un protocolo para generar un organoide cerebral humano que contenga microglía y neuronas residentes mediante la incorporación de células hematopoyéticas derivadas de células madre pluripotentes inducidas en el proceso de inducción y desarrollo de organoides neuronales. Este método proporciona un modelo para estudiar las interacciones entre la microglía y las neuronas durante el desarrollo del cerebro humano. Los organoides cerebrales 3D son mini cerebros generados a partir de células madre pluripotentes inducidas o iPSC.
Como alternativa a los animales y a los seres humanos, se han utilizado ampliamente para imitar cerebros humanos en la investigación del desarrollo cerebral y los trastornos neurológicos. Son excelentes herramientas para avanzar en la investigación en salud humana. Los protocolos convencionales para organoides cerebrales humanos en 3D rara vez generan microglía, la célula inmunitaria residente del cerebro humano, ya que estas células surgen de un linaje embrionario diferente al de las neuronas.
Si bien la microglía se puede agregar a los organoides cerebrales en una etapa posterior de diferenciación, se necesita un método para imitar mejor el desarrollo del cerebro humano. La mayoría de los otros protocolos añaden HPC o microglía al final de la generación de organoides cerebrales. Generamos cuerpos embrioides a partir de iPSCs y HPCs mixtas antes de la inducción neuronal.
Esto puede imitar mejor el desarrollo del cerebro humano, ya que los precursores de la microglía migran al cerebro muy temprano en el desarrollo. Además, el uso de HPC ahorra tiempo total de diferenciación, ya que los protocolos de diferenciación de la microglía suelen tardar más de 30 días. Por lo tanto, nuestro protocolo puede ahorrar tiempo y costos de reactivos.
Para empezar, se cultivaron células madre pluripotentes inducidas por humanos disociadas o iPSC en una placa de 12 pocillos que contenía un mililitro de medio E8 Flex, se incubaron las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Al día siguiente, revise las colonias bajo el microscopio y cuente el número de colonias escaneando todos los campos en un pozo. Reemplace el medio con un mililitro de medio A del kit hematopoyético.
Vuelva a colocar la placa en la incubadora durante 48 horas. Al tercer día, reemplace 500 microlitros del medio gastado por 500 microlitros de medio A fresco e incube durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, observe el crecimiento celular y la diferenciación de las colonias de iPSC.
Reemplace el medio con un mililitro de medio B. Controle la diferenciación celular bajo el microscopio y realice un cambio de medio medio con 500 microlitros de medio B cada dos días durante seis a siete días. En el día 10, observe la presencia de células redondas individuales brillantes con la morfología de las células progenitoras hematopoyéticas normales, o HPC, flotando o unidas libremente a la célula de capa plana con algunos agregados sueltos. A continuación, recoja todas las HPC diferenciadas pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres veces con una punta de pipeta de un mililitro.
Transfiera las células a un tubo de 15 mililitros. Centrifugar la suspensión celular a 300 G durante cinco minutos y resuspender el pellet en un mililitro de medio B. Agregue 20 microlitros de suspensión celular en una cámara de conteo celular y cuente las células con un medidor de celdas. Ajustar la concentración celular a 1 millón de células por mililitro utilizando el medio B. La técnica de cultivo por dilución en serie produjo un número y tamaño adecuados de colonias de iPSC con colonias que mostraron cambios morfológicos significativos al final del cultivo en el medio A. Después de tres días en el medio B, se observó diferenciación de HPC con la aparición de células redondas homogéneas.
A los 10 días, las HPC formaron predominantemente grupos similares a colonias sin residuos significativos. Después de recolectar HPCs diferenciadas de las iPSCs humanas, verifique que el cultivo de una iPSC haya alcanzado el 80% de confluencia. Agregue 500 microlitros de solución de enjuague antiadherente en un pocillo de la placa de micropocillos, minimizando la formación de burbujas.
Gire la placa a 2.000 G durante cinco minutos en un rotor de cubo oscilante equipado con soportes para placas. Retire completamente la solución de enjuague y lave los pocillos dos veces con un mililitro de DPBS y luego con un mililitro de DMEM/F-12 sin generar burbujas. Tratar las iPSC con un mililitro de solución de ACCUTASE para iniciar la disociación celular.
Observe las células bajo el microscopio, notando signos de separación celular mientras las células permanecen unidas al fondo. Reemplace la solución ACCUTASE con un mililitro de medio DMEM/F-12, luego mezcle hacia arriba y hacia abajo para disociar las células en células individuales. Transfiera las células disociadas a un tubo de 15 mililitros y agregue medio DMEM/F-12 para alcanzar un volumen final de cinco mililitros.
Centrifugar las células a 300 g durante cinco minutos y resuspender el pellet en un mililitro de medio E8 Flex. Cuente las celdas para ajustar la concentración de celdas a 1 millón de celdas por mililitro en el medio E8 Flex. A continuación, mezcle las iPSC con las HPC en una proporción de dos a uno en el pocillo de la placa de cultivo de micropocillos.
Agregue un microlitro de solución madre de ROCK Inhibitor Y-27632 por mililitro de medio en el sobrenadante y agite la placa de lado a lado. Gire la placa a 300 g durante cinco minutos y observe bajo el microscopio para confirmar que las células se han asentado en los micropocillos. Incubar las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
Después de 48 horas, observe las células bajo el microscopio para detectar la formación de cuerpos embrioides, o EB. A continuación, trate una placa de cultivo celular de 24 pocillos con 500 microlitros de tampón de enjuague antiadherente durante 15 minutos para crear una placa de fijación baja. Lave los pocillos dos veces con un mililitro de DPBS y agregue un mililitro de medio E8 Flex a cada pocillo.
Con una punta de pipeta de orificio de un mililitro de ancho, vuelva a suspender los EB en la placa de cultivo de micropocillos. Luego, para cada pocillo de la placa de 24 pocillos de baja fijación, agregue 100 microlitros de medio que contenga los EB. Incube la placa en una incubadora de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 48 horas.
Para comenzar, descongele las alícuotas de la matriz de la membrana basal en hielo durante 30 minutos. En el segundo día después de la formación de EB, utilizando una punta de pipeta preenfriada de 20 microlitros, agregue 15 microlitros de matriz de membrana basal helada en pequeñas gotas sobre el medio para cubrir los EB. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 48 horas.
Al cuarto día después de la formación de EB, retire cuidadosamente 500 microlitros de medio sin alterar los EB y repita el recubrimiento de la matriz de la membrana basal como se demostró anteriormente. A continuación, añade 500 microlitros de medio de inducción neural de células madre pluripotentes sobre las células. Coloque la placa en una incubadora de celdas de 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
En el día seis y ocho, realice un cambio de medio reemplazando cuidadosamente 500 microlitros de medio con 500 microlitros de medio de inducción neuronal fresco. Después de la incubación en los días 10, 12 y 14, realice un cambio de medio medio con medio de células madre neurales. El día 15, transfiera las esferas que contienen pocillos, junto con el medio, a una nueva placa de 12 pocillos tratada con solución de enjuague antiadherente.
Añadir 500 microlitros de medio de maduración neuronal sobre el cultivo. Durante la etapa de maduración, controle el medio en busca de signos de agotamiento de nutrientes, como un cambio de color. Si se observa un agotamiento de nutrientes, transfiera el organoide a una placa de seis pocillos.
El día 17, suplementar el medio de maduración con citoquinas durante seis días para facilitar la maduración microglial. Finalmente, el día 23, recolecta los organoides neuronales resultantes para su caracterización. Las mezclas de HPC e iPSC de alta calidad formaron EB en 24 horas, mostrando un crecimiento continuo y residuos mínimos.
Después de la transferencia a una nueva placa, EBS continuó creciendo hasta alcanzar una meseta en el medio de maduración.
