Esta investigación demuestra un enfoque novedoso para el estudio de la terapéutica y la patobiología del cáncer apendicular en un entorno preclínico. Estos métodos pueden ser más ampliamente aplicables al estudio de otras neoplasias malignas. El cáncer de apéndice es difícil de estudiar dada su baja incidencia en ausencia de un apéndice en ratones para el modelado de enfermedades.
Esta técnica permite el estudio de las interacciones celulares dentro del microambiente tumoral. Este método se puede aplicar para estudiar la biología de múltiples tipos de cánceres que tienen la propensión a hacer metástasis al epiplón, como los cánceres colorrectal y de ovario. Comience por preparar los medios de transporte y cultura.
A la llegada del tejido, transfiera los tejidos tumorales del pseudomixoma peritonei a 35 DMEM completos que contengan seis platos de centímetros de diámetro. Además de eliminar cualquier mucina licuada, o regiones de tejido altamente mucinoso, elimine cualquier tejido que sea difícil de cortar con un bisturí. Cortar los nódulos de tejido tumoral aproximadamente en pedazos cúbicos de un centímetro más pequeños.
para la preparación de agarosa y la incrustación de tejidos, prepare una solución al 5% de agarosa de bajo punto de fusión en PBS sin suero bovino fetal o FBS el mismo día si llegan los tejidos. Agregue la solución líquida de agarosa al 5% a los platos de seis centímetros que contienen dos o tres muestras tumorales más pequeñas hasta que cubra la muestra. Coloque los pañuelos incrustados en un refrigerador de cuatro grados centígrados durante 30 minutos.
Desmonte las muestras de tejido en el vibratomo, retire la barrena solidificada del refrigerador y corte los cubos de agarosa ligeramente más grandes que el ancho del tejido con un bisturí. Aplique súper pegamento a la etapa de vibratomo y coloque suavemente el cubo de agarosa sobre el súper pegamento durante uno o dos minutos para la fijación. Fije la cuchilla al vibratomo y ajuste el grosor de la sección de tejido a aproximadamente 150 a 250 micras para obtener imágenes aguas abajo óptimas.
Para cultivar las rodajas de tejido, prepare una placa de inserción permeable agregando dos mililitros de medios DMEM completos por encima de la membrana permeable y tres mililitros por debajo de la membrana permeable. A continuación, levante suavemente las rodajas de tejido de la cámara de corte del vibratomo con un pincel delgado y coloque de dos a cuatro rodajas en platos de cultivo permeables que contengan DMEM completo. Cultive las rodajas durante un máximo de siete días a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%.
Durante el reemplazo de medios, cada 24 horas, agregue bortezomib como controles para la destrucción celular y quimioterapias comprobables con 5-fluorouracilo, o 5-FU, a los medios de cultivo para realizar la intervención farmacológica. Coloque cortes tumorales para el análisis de imágenes confocales en un solo pocillo de una placa de 12 pocillos que contenga PBS con 1% de FBS. Para experimentos de imágenes de calcio, en lugar de PBS, incubar las rodajas en una solución de calcio extracelular.
Manchar muestras con tintes de imagen para determinar la viabilidad de los cortes de tejido. Incubar durante 10 minutos a una hora después de agregar el tinte de viabilidad. Después de la incubación, transfiera las rodajas a una placa de Petri con fondo de vidrio ópticamente transparente que contenga PBS con 1% de FBS para ser utilizada para obtener imágenes en un dispositivo de imágenes confocales.
Corte una pieza pequeña del extremo de una punta de pipeta de un mililitro para ensanchar la abertura, permitiendo una disociación mecánica vigorosa por pipeteo. Incubar rodajas a 37 grados centígrados con rotación durante cinco a 15 minutos en un mililitro de tampón de digestión, con una alteración vigorosa del tejido de dos a tres veces durante la incubación mediante disociación mecánica. Una vez que se digiere el tejido, transfiera el tejido interrumpido con medios de digestión en un filtro de 70 micrómetros colocado encima de un tubo cónico de 50 mililitros.
Escoja piezas más grandes con pinzas estériles o una pipeta. Usando el extremo posterior romo de una jeringa de plástico de cinco mililitros, triture las rodajas no disociadas más grandes y lávelas con cuatro mililitros de PBS que contengan 2% de FBS. Tome el sobrenadante de células disociadas y centrifugar a 300 G durante cinco a 10 minutos.
Retire el sobrenadante y lave el pellet con un mililitro de PBS que contenga 2% de FBS. Para preparar la muestra para la citometría de flujo, agregue el tampón de bloqueo que contiene 50 microlitros de bloque FC humano e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Realizar tinción extracelular utilizando los anticuerpos respectivos en 50 microlitros de PBS que contienen 2% de FBS.
Alícuota cinco mililitros de medio completo para condiciones de control y tratamiento. En las dos a cuatro rebanadas emplatadas en los platos permeables, agregue los medios de las alícuotas de tratamiento de control y las terapias combinadas adicionales que se utilizarán para la viabilidad posterior, el análisis de muertos vivos. Deje las rodajas de tejido en un cultivo que contenga DMEM completo durante dos a cinco días, cambiando los medios, así como bortezomib y 5-FU cada dos días.
Para el análisis de viabilidad luminiscente, agregue 500 microlitros de PBS en un plato de 12 pocillos y transfiera las rodajas de tejido secuencialmente emparejadas a la solución de PBS usando un pincel o una pipeta de un mililitro. Retire el PBS de las rodajas. Agregue 500 microlitros de la solución de viabilidad luminiscente por condición e incube con una rotación lenta en el agitador a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de leer la luminiscencia utilizando un lector de placas de luminiscencia.
La tinción de mucina en cortes de tejido se visualizó utilizando tinción periódica de cambio ácido y anticuerpos específicos de mucina. La incubación en calceína AM y yoduro de propidio determinó la salud y viabilidad. Los núcleos se superpusieron a las células que proliferaron durante el cultivo.
Estos resultados se cuantificaron para determinar el número de células proliferantes dentro del corte tumoral. Las rebanadas incubadas en el anticuerpo conjugado CD11b PE y Fluo-4 AM, marcaron las células inmunes locales en CTU. Las imágenes a escala de pseudocolor que muestran los niveles de calcio intracelular permitieron visualizar niveles diferenciales de calcio intracelular.
Aquí se muestra la actividad espontánea rastreada y el tiempo transcurrido antes, durante y después de la respuesta intercelular al calcio dentro de la célula inmune CD11b positiva resaltada. Se cuantificaron los rastros crudos de respuestas de calcio en la célula inmune CD11b, junto con otras células sensibles y no sensibles. Aquí se muestran resultados representativos del inmunotipado de una muestra tumoral de paciente con pseudomixoma peritonei.
La cuantificación del perfil inmunológico tumoral mostró que la muestra 337 del donante tiene altos niveles de macrófagos M2, lo que indica que la utilización de cortes de tejido derivados del pseudomixoma peritonei permitió interrogar el paisaje celular único del donante de las muestras tumorales del paciente. El farmacotipado y el análisis posterior de cortes de tejido de tejidos humanos pseudomixoma peritonei mostraron la destrucción de células en cortes tumorales confirmada por el análisis de citotoxicidad y las imágenes confocales de túnel. En respuesta al fármaco citotóxico, bortezomib y 5-fluorouracilo.
El análisis de viabilidad luminiscente se realizó utilizando cortes emparejados secuencialmente. La producción exitosa de cortes de tumores mucinosos requiere una disección meticulosa y la eliminación de componentes de tejido celular y acelular como la grasa y el tejido denso de la pared abdominal. Esta técnica puede permitir modelar interacciones entre las células cancerosas y múltiples tipos de células en el microambiente tumoral, como las interacciones de células adiposas, vasculares e inmunes.
