Se han generado cortes de tejido organotípico a partir de varios tejidos. Debido a la integridad preservada del tejido y al desarrollo de técnicas de cultivo, han sido adecuados para modelar mecanismos fisiológicos complejos. Los cultivos de cortes organotípicos de carcinomas de páncreas recalculan de cerca la arquitectura multicelular del tumor y su microambiente ex vivo.
Se pueden utilizar para diversas aplicaciones posteriores, como las pruebas de respuesta a fármacos. Se pueden cultivar inmediatamente después de la resección quirúrgica del tumor y son económicos y requieren menos tiempo en comparación con la mayoría de las otras técnicas de cultivo primario. La demostración del procedimiento estará a cargo de Olha Lapshyna, asistente técnica de la Universidad de Lübeck.
Para comenzar, prepare 100 mililitros de agarosa al 8% de bajo punto de fusión disolviendo ocho gramos de agarosa en 100 mililitros de solución de ringer precalentada y guárdela a cuatro grados centígrados hasta que la necesite. Tras el anuncio de la resección del tumor, derrita la agarosa en un microondas. Coloque la agarosa en un baño de agua precalentado, dejando que se enfríe a temperaturas fisiológicas antes de la preparación.
Coloque una hoja de afeitar en el soporte del Vibratome y realice un ajuste de ángulo automatizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Enfríe la camisa de la cámara de corte con una unidad de enfriamiento o hielo húmedo. Llene la cámara de corte con aproximadamente 100 mililitros de solución de anillo, luego coloque la hoja de afeitar montada en la solución de corte preenfriada, permitiendo que la hoja de afeitar se enfríe.
Lave la muestra de tejido con PBS enfriado y colóquela en una placa de Petri grande de 14 centímetros con hielo. Retire el exceso de tejido conectivo macroscópicamente visible en hielo con un bisturí. Coloque el pañuelo en una placa de Petri pequeña.
Ajuste la orientación del tejido, de modo que el tejido conectivo macroscópicamente visible restante tenga la misma orientación que el plano de la parte inferior de la placa de Petri. Vierta la agarosa de bajo punto de fusión preparada en la pequeña placa de Petri, reajustando la orientación del tejido. Si es necesario, con fórceps, coloque la placa de Petri sobre hielo húmedo para un endurecimiento más rápido de la agarosa.
Corta cuidadosamente el tejido con un bisturí, dejando al menos cinco milímetros de agarosa circundante a cada lado del tejido. Agregue pegamento al portamuestras, extiéndalo y transfiera el tejido incrustado y péguelo en el portamuestras con superpegamento. Después de unos segundos, coloque el portamuestras en la cámara de corte y ajuste la orientación del tejido hacia la hoja de afeitar si es necesario.
Defina los límites exteriores del rango de corte de acuerdo con el tamaño de la muestra de tejido. Ajuste la cuchilla hacia la parte superior del bloque de tejido. Ajuste la velocidad de corte a 0,04 milímetros por segundo, la amplitud de corte a un milímetro y el grosor de la rebanada a 300 micrómetros.
Corta con cuidado las primeras rodajas y transfiere las rodajas a un recipiente separado con una solución de ringer preenfriada sobre hielo húmedo. Prepare un plato de seis pocillos con un mililitro del medio de cultivo adecuado por pocillo. Coloque la placa de seis pocillos con el medio en una incubadora, permitiendo que la temperatura y el pH se ajusten antes del cultivo.
Coloque las rodajas en los insertos de cultivo celular con un filtro de mirada, luego elimine el exceso de solución de timbre colocando el filtro cargado sobre un paño estéril. Coloque el filtro cargado en la placa de seis pocillos preparada sin agregar ningún medio adicional al inserto, luego coloque la placa de seis pocillos en una incubadora y cambie el medio cada dos días. Coloque el filtro de cultivo con la rebanada montada en una placa de Petri.
Con un bisturí, corte con cuidado la membrana del filtro con la rebanada de tejido montada. Transfiera la membrana del filtro con el corte montado a una bolsa de nailon de biopsia y colóquela en un casete de inclusión. Posteriormente, transfiera los casetes de plástico a un recipiente con formalina preenfriada al 4,5% durante un mínimo de 24 horas o hasta su uso posterior.
Enjuague cuidadosamente el cultivo de rodajas fijas de formalina con agua corriente del grifo durante 1,5 horas. Deshidratar el corte de tejido fijado en formalina por incubación en etanol al 70% 95% y absoluto. A continuación, limpie el corte de tejido fijado en formol con dos incubaciones de tres horas en xileno.
Sumerja el tejido con parafina a 60 grados centígrados durante la noche y luego nuevamente durante dos horas. Incruste el tejido en un bloque de parafina en un molde de inclusión de tejido y colóquelo sobre hielo para enfriar la muestra más rápido. Sección el bloque de tejido incrustado en parafina a cuatro micrómetros de espesor con un micrótomo y en un baño de agua a 40 grados centígrados que contenga agua destilada.
Transfiera las secciones a portaobjetos de vidrio. Incubar secciones de parafina durante una hora a 60 grados centígrados para unir el tejido al vidrio. Luego, incuba los portaobjetos durante la noche a 37 grados centígrados.
Desparafinar las secciones por incubación en xileno tres veces durante cinco minutos cada una. A continuación, rehidratar mediante incubaciones sucesivas en alcohol absoluto, 95% de alcohol y 70% de alcohol. Tiñe las secciones con la solución de hematoxilina Mayer durante cinco minutos y enjuaga con agua corriente del grifo durante 10 minutos.
Contratinción en solución de ESN al 0,5% durante 40 segundos y enjuague con agua destilada, luego repita la deshidratación en etanol. Limpie el tejido en tres cambios de xileno durante unos segundos cada uno, luego coloque una gota de medio de montaje y cubra los portaobjetos con un cubreobjetos. La morfología macroscópica de cada OTSC disminuyó durante el cultivo durante seis días.
La viabilidad se guarda para las OTSC de dos tumores primarios representativos en dos medios diferentes mostró una disminución de la viabilidad después del día cero debido al procedimiento de corte y el ajuste a las condiciones de cultivo, así como un aumento en la viabilidad de la muestra tumoral en el panel derecho. Las secciones de tinción de H&E mostraron que la estructura general del tejido se conservó durante todo el tiempo de cultivo ex vivo, y que no se detectaron cambios macroscópicos de proliferación y apoptosis durante el período de cultivo de seis días. La evaluación histopatológica microscópica de las secciones de H&E no reveló un aumento sustancial de la necrosis de todos los tejidos cultivados durante el cultivo.
Hubo un aumento en las células positivas para caspasa-3 escindidas después de cultivar un adenocarcinoma ductal pancreático primario, o PDAC, durante 15 días. La histopatología de una metástasis peritoneal de un PDAC demostró una alta heterogeneidad intratumoral entre cortes individuales, así como una apoptosis natural medida por tinción de caspasa-3 escindida. La tinción de H&E y la caracterización inmunohistológica de la citoqueratina 7 en una metástasis de PDAC de la pared abdominal mostraron que las OTSC derivadas no contenían células tumorales, sino que solo consistían en tejido conectivo, que estaba parcialmente necrótico.
Cada corte cultivado se puede perfilar individualmente, dependiendo de la pregunta de investigación específica, por ejemplo, mediante secuenciación de ARN para transcriptómica o imágenes leves para proteómica resuelta espacialmente. En el futuro, la combinación con métodos analíticos no destructivos tiene un gran potencial para predecir las respuestas específicas del paciente a diferentes regímenes terapéuticos.
