Los métodos tradicionales de cultivo difusal a menudo no logran recapitular el complejo entorno de los órganos vivos, lo que lleva a la pérdida de marcadores y funciones específicos del tejido. Hemos desarrollado un chip abierto que combina el cultivo difusal y el principio microfluídico para imitar de cerca el microambiente de los tejidos epiteliales. Al incluir señales bioquímicas y biomecánicas que están naturalmente presentes en los órganos vivos, pero que a menudo son descuidadas por los modelos tradicionales in vitro, el chip abierto representa una mejor alternativa entre sistemas cerrados.
Demostrando el procedimiento estará Adya Panchal hoy, una estudiante de investigación en mi laboratorio. Para comenzar, coloque los reactivos necesarios debajo del gabinete de bioseguridad en hielo. Cultive células mesenquimales específicas del tejido para obtener una confluencia del 80% al 90% y luego disocie las células usando tripsina u otros métodos según las recomendaciones del fabricante.
Granular las células a 250 g durante cinco minutos a 24 grados centígrados. Resuspenda el pellet celular en 225 microlitros de EMEM 10X helado y tampón de reconstrucción. Mezclar las células por pipeteo y añadir 1.800 microlitros de solución helada de colágeno 1.
A continuación, mezcle la solución de pre-gel en hielo pipeteando hacia arriba y hacia abajo de cinco a seis veces. Neutralice la solución de pregel con 18 microlitros de un hidróxido de sodio normal, mezcle suavemente con pipeteo y luego pipete 150 microlitros de hidrogel cargado de células en la cámara central del chip abierto evitando burbujas. Agrupe las fichas en placas de Petri separadas, incluida una tapa de tubo de centrífuga llena de dos mililitros de agua estéril de doble destilación en cada placa de Petri, e incube las placas de Petri a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Para realizar el micropatrón superficial del hidrogel estromario, pipetea 20 microlitros de la solución de pregel de colágeno 1 neutralizado en la superficie estampada de un sello estéril impreso en 3D e inserta el sello dentro de la cámara abierta mientras el hidrogel estromal todavía está en forma líquida. Retire cualquier residuo de hidrogel que pueda derramarse de la parte superior de la cámara superior abierta con un aspirador. Agrupe todas las fichas en placas de Petri separadas con una tapa de tubo cónica llena de agua como se demostró anteriormente.
E incubar todas las placas de Petri a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 90 minutos. Al final de la incubación, vuelva a colocar las virutas debajo del gabinete de bioseguridad y retire suavemente los sellos con pinzas de precisión para reducir el riesgo de dañar el hidrogel. Una vez que las células cultivadas alcanzan una confluencia del 80% al 90%, disociar las células utilizando procedimientos de enzimas proteolíticas según lo recomendado por el proveedor celular.
Después de la disociación, granular las células por centrifugación y resuspender las células epiteliales a la densidad de fragmentos celulares apropiada como se describe en el manuscrito. Para sembrar la célula epitelial, transfiera las virutas de la incubadora al gabinete de bioseguridad y enjuague la superficie estromal tres veces con 100 microlitros de medio de cultivo de células epiteliales frescas para eliminar cualquier exceso de solución de recubrimiento. Una vez que se aspire el medio de enjuague, siembre la superficie del hidrogel con 50 microlitros de la suspensión de células epiteliales utilizando la densidad celular adecuada y luego transfiera las virutas nuevamente a la incubadora durante dos horas.
Para eliminar los residuos celulares, enjuague suavemente la superficie del hidrogel con el medio de cultivo celular dos veces, refresque el medio en autoclave en recipientes sellados en autoclave y conecte las virutas a la bomba peristáltica. Pause la bomba peristáltica, desconecte cuidadosamente los chips de la bomba y extraiga el portador de la carcasa del chip. Después de transferir los chips de la incubadora al gabinete de bioseguridad, retire el volumen del medio que queda en el depósito superior.
Luego, aspire todo el medio desde el canal microfluídico superior suavemente y sujete el tubo microfluídico corto conectado a las entradas superiores usando clips aglutinantes para reducir la evaporación del medio y el mantenimiento de la interfaz aire-líquido, o ALI. Coloque el chip abierto en el soporte de la carcasa de nuevo en la incubadora. Vuelva a conectar los chips a la bomba peristáltica y reanude el flujo iniciando la bomba peristáltica.
Enjuague la cámara vascular con medio de cultivo de células endoteliales y luego siembre 25 microlitros de suspensión de células endoteliales. Voltea los chips boca abajo para permitir que las células endoteliales se adhieran a la superficie superior de la cámara microfluídica. Agrupe las fichas en placas de Petri.
Colóquelos de nuevo en la incubadora como se demostró anteriormente y deje que las células endoteliales se adhieran durante una hora. Al final de la incubación, transfiera las virutas de la incubadora al gabinete de bioseguridad y enjuague el canal vascular con medio de cultivo de células endoteliales dos veces para eliminar los desechos celulares. Coloque las virutas planas para facilitar la adhesión de las células endoteliales a la superficie inferior del canal vascular.
Llene el reservorio del medio vascular con el medio de cultivo celular vascular desgasificado debajo del gabinete de bioseguridad. Vuelva a colocar los chips dentro del portador de la carcasa del chip y vuelva a conectar los chips a los depósitos medianos en un extremo y a la bomba peristáltica en el otro. Inspeccione las conexiones microfluídicas para asegurarse de que todos los chips estén conectados correctamente y que no haya gotas visibles de goteo medio.
Luego, reanude el flujo de fluido iniciando la bomba peristáltica. Se visualiza la superficie de gel microestampada con y sin células. El análisis histológico reveló epidermis estratificada multicapa madura diferenciada en chip.
La imagen de la vista superior del chip de piel mostró la presencia de los fibroblastos dentro de la capa dérmica. PECAM-1, VE-cadherina y von Willebrand mostraron la diferenciación de células endoteliales microvasculares humanas cocultivadas en el chip de piel abierta. MUC5AC, alfa y beta tubulina, proteína clorocelular 16, p63 y tinción fluorescente ZO-1 mostraron epitelio maduro de las vías respiratorias.
Los cilios palpitantes y el epitelio pseudoestratificado maduro diferenciado se observaron en el chip de las vías respiratorias abiertas. La tinción fluorescente tipo I, tipo II y E-cadherina mostró la presencia de neumocitos maduros en chip. La microscopía electrónica reveló la presencia de microvellosidades y vesículas lisosomales, evidencia de fenotipo alveolar maduro.
El análisis histológico mostró la presencia de células escamosas planas consistentes con el fenotipo Tipo I, y células cuboidales similares a adoquines coherentes con el fenotipo Tipo II, y fibroblastos dentro de la capa dérmica. La presencia de enterocitos y la copa madura fue confirmada por mucina 2 y tinción de E-cadherina. Los fibroblastos dentro de la capa dérmica confirmaron la presencia de un epitelio columnar simple.
Todos los reactivos deben estar fríos y las superficies del gel deben enjuagarse adecuadamente para obtener una superficie uniforme. Es importante eliminar cualquier célula no adherente y residuos para obtener una adhesión celular uniforme y una monocapa y pared vascular compacta. Se puede emplear un enfoque similar para generar otros tipos de modelos de órganos epiteliales, como el intestino y el pulmón, para evaluar cómo medicamentos específicos o factores ambientales pueden afectar la homeostasis de los tejidos humanos, con un énfasis particular en la función de barrera epitelial y vascular.
Con fácil acceso a la fase de eficacia del compartimiento del estroma, la investigación ahora puede generar patrones faciales específicos y reproducir la arquitectura funcional del tejido, como el cryptviveoli, que es difícil de lograr con otros dispositivos.
