Geleneksel difüzal kültür yöntemleri genellikle canlı organların karmaşık ortamını özetlemekte başarısız olmakta ve dokuya özgü belirteçlerin ve fonksiyonların kaybına yol açmaktadır. Epitel dokularının mikro ortamını yakından taklit etmek için difüzal kültürü ve mikroakışkan prensibini birleştiren üstü açık bir çip geliştirdik. Canlı organlarda doğal olarak bulunan ancak geleneksel in vitro modeller tarafından sıklıkla ihmal edilen biyokimyasal ve biyomekanik ipuçlarını içererek, üstü açık çip kapalı sistemler arasında daha iyi bir alternatifi temsil eder.
Prosedürü gösteren, bugün laboratuvarımda bir araştırma öğrencisi olan Adya Panchal olacak. Başlamak için, gerekli reaktifleri buz üzerindeki biyogüvenlik kabininin altına getirin. Kültür dokusuna özgü mezenkimal hücreler% 80 ila% 90 akıcılık elde etmek ve daha sonra üreticinin tavsiyelerine göre tripsin veya diğer yöntemleri kullanarak hücreleri ayrıştırmak.
Hücreleri 250 g'da 24 santigrat derecede beş dakika boyunca pelet yapın. Hücre peletini buz gibi soğuk 10X EMEM ve rekonstrüksiyon tamponunun her biri 225 mikrolitrede yeniden askıya alın. Hücreleri pipetleyerek karıştırın ve 1.800 mikrolitre buz gibi soğuk Kollajen 1 çözeltisi ekleyin.
Ardından, ön jel çözeltisini beş ila altı kez yukarı ve aşağı pipetleyerek buz üzerinde karıştırın. Ön jel çözeltisini 18 mikrolitre bir normal sodyum hidroksit ile nötralize edin, pipetleme ile hafifçe karıştırın ve ardından kabarcıkları önlerken üstü açık çipin merkezi odasına 150 mikrolitre hücre yüklü hidrojel pipetleyin. Cipsleri, her Petri kabında iki mililitre steril çift damıtılmış su ile doldurulmuş bir santrifüj tüpü kapağı da dahil olmak üzere ayrı Petri kapları halinde gruplandırın ve Petri kaplarını 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Stromal hidrojelin yüzey mikrodesenlemesini gerçekleştirmek için, nötralize edilmiş Kollajen 1 ön jel çözeltisinin 20 mikrolitresini steril bir 3D baskılı damganın desenli yüzeyine pipet edin ve damgayı stromal hidrojel hala sıvı formdayken üstü açık odanın içine yerleştirin. Bir aspiratör kullanarak üstü açık odanın üstünden dökülebilecek hidrojel kalıntılarını temizleyin. Tüm cipsleri, daha önce gösterildiği gibi suyla doldurulmuş konik bir tüp kapağı ile ayrı Petri kapları halinde gruplandırın.
Ve tüm Petri kaplarını 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 90 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, cipsleri biyogüvenlik kabininin altına geri getirin ve hidrojele zarar verme riskini azaltmak için hassas cımbız kullanarak damgaları yavaşça çıkarın. Kültürlenmiş hücreler% 80 ila% 90 akıcılığa ulaştığında, hücre sağlayıcısı tarafından önerilen proteolitik enzim prosedürlerini kullanarak hücreleri ayırın.
Ayrışmadan sonra, hücreleri santrifüjleme ile pelet edin ve epitel hücrelerini makalede açıklandığı gibi uygun hücre parçası yoğunluğuna yeniden askıya alın. Epitel hücresini tohumlamak için, cipsleri inkübatörden biyogüvenlik kabinine aktarın ve fazla kaplama çözeltisini gidermek için stromal yüzeyi 100 mikrolitre taze epitel hücre kültürü ortamı ile üç kez durulayın. Durulama ortamı aspire edildikten sonra, hidrojel yüzeyini uygun hücre yoğunluğunu kullanarak 50 mikrolitre epitel hücre süspansiyonu ile tohumlayın ve ardından cipsleri iki saat boyunca inkübatöre geri aktarın.
Hücresel kalıntıları gidermek için, hidrojel yüzeyini hücre kültürü ortamıyla iki kez nazikçe durulayın, kapalı otoklavlanabilir kaplarda otoklavlayarak ortamı yenileyin ve talaşları peristaltik pompaya bağlayın. Peristaltik pompayı duraklatın, talaşları pompadan dikkatlice ayırın ve talaş gövdesi taşıyıcısını çıkarın. Talaşları inkübatörden biyogüvenlik kabinine aktardıktan sonra, kalan ortamın hacmini üst hazneye çıkarın.
Ardından, tüm ortamı üst mikroakışkan kanaldan nazikçe aspire edin ve ortam buharlaşmasını ve hava-sıvı arayüzünün veya ALI'nin bakımını azaltmak için bağlayıcı klipsler kullanarak üst girişlere bağlı kısa mikroakışkan boruyu sıkıştırın. Üstü açık çipi muhafaza taşıyıcısına geri inkübatöre yerleştirin. Talaşları peristaltik pompaya yeniden bağlayın ve peristaltik pompayı başlatarak akışa devam edin.
Damar odasını endotel hücre kültürü ortamı ile durulayın ve ardından 25 mikrolitre endotel hücre süspansiyonu tohumlayın. Endotel hücrelerinin mikroakışkan odanın üst yüzeyine yapışmasına izin vermek için çipleri baş aşağı çevirin. Cipsleri Petri kapları halinde gruplandırın.
Onları daha önce gösterildiği gibi inkübatöre geri yerleştirin ve endotel hücrelerinin bir saat boyunca bağlanmasına izin verin. İnkübasyonun sonunda, cipsleri inkübatörden biyogüvenlik kabinine aktarın ve hücresel kalıntıları gidermek için vasküler kanalı endotel hücre kültürü ortamıyla iki kez durulayın. Endotel hücrelerinin vasküler kanalın alt yüzeyine yapışmasını kolaylaştırmak için çipleri düz bir şekilde yerleştirin.
Vasküler ortam rezervuarını, biyogüvenlik kabininin altındaki gazdan arındırılmış vasküler hücre kültürü ortamı ile doldurun. Talaşları tekrar talaş gövdesi taşıyıcısının içine yerleştirin ve talaşları bir ucundaki orta rezervuarlara ve diğer ucundaki peristaltik pompaya yeniden bağlayın. Tüm talaşların doğru şekilde bağlandığından ve görünür orta damlama damlacıkları olmadığından emin olmak için mikroakışkan bağlantıları inceleyin.
Ardından, peristaltik pompayı başlatarak sıvı akışını sürdürün. Hücreli ve hücresiz mikrodesenli jel yüzeyi görselleştirilir. Histolojik analizde çip üzerinde farklılaşan olgun çok katmanlı tabakalı epidermis saptandı.
Cilt çipinin üstten görünümü, dermal tabakanın içindeki fibroblastların varlığını gösterdi. PECAM-1, VE-kadherin ve von Willebrand, üstü açık cilt çipinde birlikte kültürlenen insan mikrovasküler endotel hücrelerinin farklılaşmasını gösterdi. MUC5AC, alfa ve beta tübülin, kloro hücre proteini 16, p63 ve ZO-1 floresan boyamasında olgun hava yolu epiteli saptandı.
Dayak atan Cilia ve farklılaşmış olgun psödo-tabakalı epitel üstü açık hava yolu çipinde gözlendi. Tip I, Tip II ve E-kadherin floresan boyaması, çip üzerinde olgun pnömositlerin varlığını gösterdi. Elektron mikroskopisi, mikrovillus ve lizozomal veziküllerin varlığını, olgun alveoler fenotipin kanıtını ortaya koydu.
Histolojik analiz, Tip I fenotiple uyumlu düz skuamöz hücrelerin ve Tip II fenotiple uyumlu küboidal parke taşı benzeri hücrelerin ve dermal tabakanın içindeki fibroblastların varlığını göstermiştir. Enterositlerin ve olgun kadehin varlığı müsin 2 ve E-kadherin boyama ile doğrulandı. Dermal tabaka içindeki fibroblastlar basit bir kolumnar epitelin varlığını doğruladı.
Tüm reaktifler soğuk olmalı ve jelin yüzeyleri düzgün bir yüzey elde etmek için yeterince durulanmalıdır. Eşit hücre yapışması ve kompakt, faul tek katmanlı ve vasküler duvar elde etmek için yapışmayan hücreleri ve kalıntıları çıkarmak önemlidir. Benzer bir yaklaşım, bağırsak ve akciğer gibi diğer epitel organ modellerini üretmek, spesifik ilaçların veya çevresel faktörlerin insan dokularının homeostazını nasıl etkileyebileceğini değerlendirmek için, epitel ve vasküler bariyer fonksiyonuna özel bir vurgu yaparak kullanılabilir.
Stroma bölmesinin etkinlik aşamasına kolay erişim sayesinde, araştırma artık belirli yüz desenleri oluşturabilir ve diğer cihazlarla elde edilmesi zor olan kriptoviveoli gibi fonksiyonel doku mimarisini yeniden üretebilir.
