전통적인 확산 배양 방법은 종종 살아있는 장기의 복잡한 환경을 재현하지 못하여 조직 특이적 마커와 기능의 상실로 이어집니다. 우리는 확산 배양과 미세 유체 원리를 결합하여 상피 조직의 미세 환경을 밀접하게 모방하는 개방형 칩을 개발했습니다. 살아있는 장기에 자연적으로 존재하지만 전통적인 체외 모델에서는 종종 무시되는 생화학적 및 생체역학적 신호를 포함함으로써 개방형 칩은 폐쇄형 시스템 간의 더 나은 대안을 나타냅니다.
이 절차를 시연하는 것은 오늘 내 실험실의 연구생 인 Adya Panchal이 될 것입니다. 시작하려면 필요한 시약을 얼음 위의 생물 안전 캐비닛 아래로 가져옵니다. 조직 특이적 중간엽 세포를 배양하여 80%에서 90%의 밀도를 얻은 다음 제조업체의 권장 사항에 따라 트립신 또는 기타 방법을 사용하여 세포를 해리합니다.
세포를 250g에서 섭씨 24도에서 5분 동안 펠렛화합니다. 세포 펠릿을 얼음처럼 차가운 225X EMEM 및 재구성 완충액의 각각 10마이크로리터에 재현탁합니다. 피펫팅으로 세포를 혼합하고 1, 800 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 콜라겐 1 용액을 첨가하십시오.
다음으로, 얼음 위에서 프리겔 용액을 5-6회 피펫팅하여 혼합합니다. 프리겔 용액을 18마이크로리터의 일반 수산화나트륨으로 중화하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합한 다음 기포를 피하면서 150마이크로리터의 셀 함유 하이드로겔을 오픈 탑 칩의 중앙 챔버에 피펫팅합니다. 각 페트리 접시에 2 밀리리터의 멸균 이중 증류수로 채워진 원심 분리기 튜브 캡을 포함하여 칩을 별도의 페트리 접시로 그룹화하고 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 페트리 접시를 배양합니다.
스트로멀 하이드로겔의 표면 마이크로패터닝을 수행하기 위해, 멸균된 3D 프린팅 스탬프의 패터닝된 표면에 중화된 콜라겐 1 프리겔 용액 20마이크로리터를 피펫팅하고, 스트로말 하이드로겔이 여전히 액체 형태인 상태에서 오픈 탑 챔버 내부에 스탬프를 삽입합니다. 흡전기를 사용하여 개방형 챔버 상단에서 쏟아질 수 있는 하이드로겔 잔류물을 제거합니다. 앞에서 설명한 것처럼 모든 칩을 물로 채워진 원뿔형 튜브 캡이 있는 별도의 페트리 접시로 그룹화합니다.
그리고 모든 페트리 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 90분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 칩을 생물 안전 캐비닛 아래로 다시 가져오고 정밀 핀셋을 사용하여 스탬프를 부드럽게 제거하여 하이드로겔 손상 위험을 줄입니다. 배양된 세포가 80%에서 90%의 밀도에 도달하면 세포 제공자가 권장하는 단백질 분해 효소 절차를 사용하여 세포를 해리합니다.
해리 후, 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 상피 세포를 원고에 기재된 바와 같은 적절한 세포 단편 밀도로 재현탁시킨다. 상피 세포를 시딩하기 위해, 칩을 인큐베이터로부터 생물 안전 캐비닛으로 옮기고, 100 마이크로리터의 신선한 상피 세포 배양 배지로 기질 표면을 3회 헹구어 과량의 코팅 용액을 제거한다. 헹굼 배지가 흡인되면 적절한 세포 밀도를 사용하여 50 마이크로 리터의 상피 세포 현탁액으로 하이드로 겔 표면을 시드 한 다음 칩을 다시 2 시간 동안 인큐베이터로 옮깁니다.
세포 파편을 제거하려면 세포 배양 배지로 하이드로겔 표면을 부드럽게 두 번 헹구고 밀봉된 오토클레이브 용기에서 오토클레이빙하여 배지를 새로 고친 다음 칩을 연동 펌프에 연결합니다. 연동 펌프를 일시 중지하고 펌프에서 칩을 조심스럽게 분리한 다음 칩 하우징 캐리어를 빼냅니다. 칩을 인큐베이터에서 생물 안전 캐비닛으로 옮긴 후 상단 저장소에 남아있는 배지의 부피를 제거하십시오.
그런 다음 상단 미세유체 채널에서 모든 배지를 부드럽게 흡인하고 바인더 클립을 사용하여 상단 입구에 연결된 짧은 미세유체 튜브를 고정하여 매체 증발 및 공기-액체 계면(ALI)의 유지를 줄입니다. 하우징 캐리어의 개방형 칩을 인큐베이터에 다시 놓습니다. 칩을 연동 펌프에 다시 연결하고 연동 펌프를 시작하여 흐름을 재개합니다.
혈관 챔버를 내피 세포 배양 배지로 헹구고 25 마이크로 리터의 내피 세포 현탁액을 시드합니다. 칩을 거꾸로 뒤집어 내피 세포가 미세유체 챔버의 상부 표면에 부착되도록 합니다. 칩을 페트리 접시로 그룹화하십시오.
앞서 설명한대로 인큐베이터에 다시 넣고 내피 세포가 1 시간 동안 부착되도록합니다. 배양이 끝나면 칩을 배양기에서 생물 안전 캐비닛으로 옮기고 혈관 채널을 내피 세포 배양 배지로 두 번 헹구어 세포 파편을 제거합니다. 혈관 채널의 바닥 표면에 내피 세포의 부착을 촉진하기 위해 칩을 평평하게 놓습니다.
혈관 배지 저장소를 생물 안전 캐비닛 아래의 탈기된 혈관 세포 배양 배지로 채웁니다. 칩을 칩 하우징 캐리어 내부에 다시 넣고 칩을 한쪽 끝의 중간 저장소와 다른 쪽 끝의 연동 펌프에 다시 연결합니다. 미세 유체 연결을 검사하여 모든 칩이 올바르게 연결되어 있고 중간 물방울이 보이지 않는지 확인합니다.
그런 다음 연동 펌프를 시작하여 유체 흐름을 재개합니다. 세포가 있거나 없는 미세 패턴의 젤 표면이 시각화됩니다. 조직학적 분석 결과 성숙한 다층 층화 표피가 칩 상에서 분화되는 것으로 나타났습니다.
피부 칩의 평면도 사진은 진피층 내부에 섬유아세포의 존재를 보여주었다. PECAM-1, VE-cadherin, von Willebrand는 open-top skin chip에서 공동 배양한 인간 미세혈관 내피세포의 분화를 보여주었다. MUC5AC, 알파 및 베타 튜불린, 클로로세포 단백질 16, p63, 및 ZO-1 형광 염색은 성숙한 기도 상피를 나타내었다.
박동 섬모 및 분화된 성숙한 유사 층화 상피가 개방 상부 기도 칩에서 관찰되었습니다. Type I, Type II 및 E-cadherin 형광 염색은 칩 상에 성숙한 폐구의 존재를 보여주었다. 전자 현미경은 성숙한 폐포 표현형의 증거인 미세 융모 및 리소좀 소포의 존재를 밝혀냈습니다.
조직학적 분석은 I형 표현형과 일치하는 편평한 편평 세포, II형 표현형과 일관된 입방체 조약돌 유사 세포 및 진피층 내부의 섬유아세포의 존재를 보여주었습니다. 장세포 및 성숙한 잔의 존재는 뮤신 2 및 E-cadherin 염색에 의해 확인되었다. 진피층 내부의 섬유아세포는 단순한 원주형 상피의 존재를 확인하였다.
모든 시약은 차가워야 하며 젤 표면은 균일한 표면을 얻기 위해 적절하게 헹궈야 합니다. 균일한 세포 접착력과 조밀한 오염 단층 및 혈관벽을 얻기 위해 부착되지 않은 세포와 파편을 제거하는 것이 중요합니다. 유사한 접근법을 사용하여 장 및 폐와 같은 다른 유형의 상피 기관 모델을 생성하여 특정 약물 또는 환경 요인이 상피 및 혈관 장벽 기능에 특히 중점을 두고 인간 조직의 항상성에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 평가할 수 있습니다.
기질 구획의 효능 단계에 쉽게 접근할 수 있게 되면서 연구를 통해 이제 특정 얼굴 패턴을 생성하고 다른 장치로는 달성하기 어려운 크립트비베올리와 같은 기능적 조직 구조를 재현할 수 있습니다.
