従来の拡散培養法では、生体臓器の複雑な環境を再現できないことが多く、組織特異的なマーカーや機能が失われていました。私たちは、拡散培養とマイクロ流体原理を組み合わせて、上皮組織の微小環境を厳密に模倣するオープントップチップを開発しました。生体臓器に自然に存在するが、従来のin vitroモデルでは無視されがちな生化学的および生体力学的手がかりを含めることにより、オープントップチップはクローズドシステム間のより良い代替手段となります。
手順を実演するのは、今日、私の研究室の研究生であるアディア・パンチャルです。はじめに、必要な試薬を氷上のバイオセーフティキャビネットの下に置きます。組織特異的間葉系細胞を培養して80%〜90%のコンフルエント性を得た後、メーカーの推奨に従ってトリプシンまたは他の方法を使用して細胞を解離します。
細胞を250gで摂氏24度で5分間ペレット化します。細胞ペレットを氷冷した10X EMEMおよび再構成バッファーのそれぞれ225マイクロリットルに再懸濁します。ピペッティングによって細胞を混合し、1, 800マイクロリットルの氷冷コラーゲン1溶液を加える。
次に、プレゲル溶液を氷上で5〜6回ピペッティングして混合します。プレゲル溶液を18マイクロリットルの通常の水酸化ナトリウム1個で中和し、ピペッティングで穏やかに混合した後、気泡を避けながら150マイクロリットルの細胞含有ヒドロゲルをオープントップチップの中央チャンバーにピペットで入れます。各ペトリ皿に2ミリリットルの滅菌二重蒸留水で満たされた遠心分離管キャップを含む、チップを別々のペトリ皿にグループ化し、摂氏37度と5%二酸化炭素でペトリ皿をインキュベートします。
ストローマヒドロゲルの表面マイクロパターニングを行うには、滅菌3Dプリントスタンプのパターン化された表面に中和コラーゲン1プレゲル溶液20マイクロリットルをピペットで移し、ストローマヒドロゲルがまだ液体の形である間にオープントップチャンバー内にスタンプを挿入します。アスピレーターを使用して、オープントップチャンバーの上部からこぼれる可能性のあるヒドロゲルの残留物を取り除きます。前に示したように、すべてのチップを水で満たされた円錐形のチューブキャップを備えた別々のペトリ皿にグループ化します。
そして、すべてのペトリ皿を摂氏37度と5%二酸化炭素で90分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、チップをバイオセーフティキャビネットの下に戻し、精密ピンセットを使用してスタンプをそっと取り除き、ヒドロゲルを損傷するリスクを減らします。培養細胞が80%から90%のコンフルエントに達したら、細胞提供者が推奨するタンパク質分解酵素手順を使用して細胞を解離します。
解離後、遠心分離によって細胞をペレット化し、原稿に記載されているように適切な細胞断片密度に上皮細胞を再懸濁する。上皮細胞を播種するには、チップをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移し、間質表面を100マイクロリットルの新鮮な上皮細胞培養培地で3回すすぎ、余分なコーティング溶液を取り除きます。リンス媒体が吸引されたら、適切な細胞密度を使用して50マイクロリットルの上皮細胞懸濁液をヒドロゲル表面に播種し、チップをインキュベーターに2時間戻します。
細胞の破片を除去するには、細胞培養培地でヒドロゲル表面を2回穏やかにすすぎ、密閉されたオートクレーブ可能な容器でオートクレーブして培地をリフレッシュし、チップを蠕動ポンプに接続します。ペリスタルティックポンプを一時停止し、チップをポンプから慎重に外し、チップハウジングキャリアを引き出します。チップをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移した後、上部のリザーバーに残っている培地の量を取り除きます。
次に、上部のマイクロ流体チャネルからすべての媒体を穏やかに吸引し、バインダークリップを使用して上部の入口に接続された短いマイクロ流体チューブをクランプして、媒体の蒸発と気液界面(ALI)の維持を減らします。オープントップチップをハウジングキャリアに置き、インキュベーターに戻します。チップをペリスタルティックポンプに再接続し、ペリスタルティックポンプを始動して流れを再開します。
血管室を内皮細胞培養培地ですすぎ、次いで25マイクロリットルの内皮細胞懸濁液を播種する。チップを逆さまにして、内皮細胞がマイクロ流体チャンバーの上面に付着できるようにします。チップをペトリ皿にグループ化します。
前に示したようにそれらをインキュベーターに戻し、内皮細胞を1時間付着させます。インキュベーションの最後に、チップをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移し、血管チャネルを内皮細胞培養培地で2回すすぎ、細胞の破片を除去します。血管チャネルの底面への内皮細胞の接着を容易にするために、チップを平らに置く。
バイオセーフティキャビネットの下の脱気された血管細胞培養培地で血管培地リザーバーを満たします。チップをチップハウジングキャリア内に戻し、チップを一方の端の媒体リザーバーともう一方の端のペリスタルティックポンプに再接続します。マイクロ流体接続を検査して、すべてのチップが正しく接続され、媒体の滴りの目に見える液滴がないことを確認します。
次に、蠕動ポンプを始動して流体の流れを再開します。細胞の有無にかかわらず、マイクロパターン化されたゲル表面が視覚化されます。組織学的分析により、チップ上で分化した成熟した多層層状表皮が明らかになりました。
皮膚チップの上面図は、真皮層の内側の線維芽細胞の存在を示した。PECAM-1、VE-cadherin、およびvon Willebrandは、オープントップスキンチップで共培養したヒト微小血管内皮細胞の分化を示しました。MUC5AC、αおよびβチューブリン、クロロ細胞タンパク質16、p63、およびZO-1蛍光染色は、成熟気道上皮を示した。
拍動繊毛と分化した成熟擬似重層上皮がオープントップ気道チップで観察されました。I型、II型、およびE-カドヘリン蛍光染色では、チップ上に成熟肺細胞の存在が示されました。電子顕微鏡検査は、成熟した肺胞表現型の証拠である微絨毛およびリソソーム小胞の存在を明らかにした。
組織学的解析では、I型表現型と一致する扁平扁平上皮細胞、II型表現型と一致する直方体玉石様細胞、および真皮層内の線維芽細胞の存在が示されました。腸細胞および成熟杯の存在は、ムチン2およびE-カドヘリン染色によって確認された。真皮層内部の線維芽細胞は単純な円柱状上皮の存在を確認した。
すべての試薬は冷たくなければならず、ゲルの表面は十分にすすがれて均一な表面を得る必要があります。接着していない細胞や破片を取り除き、細胞接着を均一にし、コンパクトな汚れた単層と血管壁を得ることが重要です。同様のアプローチを使用して、腸や肺などの他のタイプの上皮器官モデルを生成し、特定の薬物または環境要因がヒト組織の恒常性にどのように影響するかを評価し、特に上皮および血管バリア機能に重点を置くことができます。
間質コンパートメントの有効性段階に簡単にアクセスできるため、研究は特定の顔パターンを生成し、他のデバイスでは達成が困難なcryptviveoliなどの機能的な組織構造を再現できるようになりました。
