Este protocolo puede proporcionar una nueva estrategia para identificar eficazmente los materiales genuinos de Clematidis armandii caulis y sus adulterantes. Este método se puede utilizar en la investigación de la calidad del material medicinal y proporciona una referencia para estudiar los estándares de calidad de otros materiales medicinales chinos. Para comenzar la preparación de la muestra, muele la materia prima a un tamaño de partícula uniforme pasándola a través de una malla de nylon con un diámetro interior apropiado.
Transfiera con precisión dos gramos de la materia prima molida en un matraz cónico de 50 mililitros tapado antes de agregar 50 mililitros de metanol al matraz. Coloque el tapón en el matraz en ultrasonido calentado a 600 vatios y 40 kilohercios durante 30 minutos. Al final de la incubación, cuele la solución de extracto medicinal a través del papel de filtro.
Después de colar, transferir cuatro mililitros de la solución de metanol que contiene los extractos medicinales a un matraz aforado de 10 mililitros. Luego agregue seis mililitros de agua y mezcle la solución. Deje que la solución se asiente durante 10 minutos.
Para el análisis HPLC de las muestras. Comience preparando las fases móviles y establezca el programa de gradiente de HPLC como se describe en el manuscrito. Filtrar la muestra a través de una membrana filtrante microporosa de 0,45 micras y someterla a análisis de HPLC.
Para cada muestra, realice el análisis seis veces al día. Para evaluar la estabilidad de la solución de muestra, analice la misma solución de muestra almacenada a temperatura ambiente durante 0, 2, 4, 6, 8, 12 y 24 horas después de la preparación. Tome seis réplicas de la misma muestra y detecte su huella digital en HPLC.
Importe los datos relevantes en el software denominado Sistema de evaluación de similitud de huellas dactilares cromatográficas de la medicina tradicional china o SESCF TCM versión 2012. Importe el tiempo de retención y el área pico para los 10 lotes de muestras auténticas de Chuanmutong, así como cinco lotes de adulterantes en SESCF TCM para su análisis. En el menú principal, haga clic en el espectro de referencia establecido y vaya a la ventana de configuración de parámetros para establecer la huella cromatográfica de referencia de la especie auténtica de Chuanmutong como referencia.
A continuación, establezca el método de generación del espectro de control como el método mediano con el ancho de la ventana de tiempo de 0.5. Luego, haga clic en calibración multipunto en el menú principal, seleccione los picos y luego seleccione la opción de coincidencia de picos como picos marcados. Finalmente, haga clic en Calcular similitud para realizar un análisis de similitud de las muestras basado en las huellas dactilares de cromatograma de referencia de Chuanmutong.
Para realizar el análisis sistémico de conglomerados, abra el software de análisis estadístico relevante y haga clic en el archivo para importar los datos de 10 lotes de muestras auténticas y cinco lotes de adulterantes al software. En el menú, en la pestaña Clasificación, haga clic en Análisis y agrupación en clústeres del sistema. Seleccione las áreas pico comunes de 10 lotes de muestras auténticas y cinco lotes de adulterantes como variables.
Establezca el número de clústeres en cuatro. A continuación, haga clic en Método para seleccionar el Método de agrupación en clústeres como conexión entre grupos. Elija el intervalo de medición como correlación de Pearson y utilice la ficha Aceptar para dibujar el mapa de análisis de conglomerados.
Para el análisis de componentes principales o PCA, abra el software de análisis de datos. Haga clic en archivo en el menú y cree un nuevo proyecto normal. Importe el área de pico de 12 picos comunes en una hoja de cálculo de Excel o similar desde el sistema HPLC.
Presione el botón Finalizar para completar la importación de datos. Para establecer el tipo de modelo con PCA, haga clic en Nuevo para crear un nuevo modelo y luego ajuste los datos usando autoajuste y agregar pestañas. Vaya a puntajes para obtener el mapa de puntaje de PCA.
Para utilizar el Análisis Ortogonal de Discriminación de Mínimos Cuadrados Parciales u OPLSDA. Genere el mapa de puntuación PCA como se demostró anteriormente. Establezca el tipo de modelo con OPLSDA haciendo clic en Nuevo y Nuevo como modelo uno Antes de ir a escala seleccionando par para todos, luego presione AutoAjustar en puntajes para generar el mapa de puntaje OPLSDA.
Para estimar la importancia de la variable y la proyección, vaya al menú del software de análisis de datos y vaya a Analizar, seguido de establecer el número en 200 por mutación. Obtenga los valores de R cuadrado y Q cuadrado de la puntuación OPLSDA y haga clic en VIP y VIP predictivo para obtener el mapa VIP. Las huellas dactilares de HPLC de las 10 muestras auténticas de Chuanmutong mostraron 12 picos comunes distintos, de los cuales el relativamente grande y bien resuelto.
El pico número 10 se utilizó como pico de referencia para estimar los tiempos de retención relativos de los picos de descanso. Las muestras auténticas demostraron grados de similitud muy cercanos a uno, lo que implica una alta similitud en buena consistencia. Sin embargo, los grados de similitud entre los cinco lotes de adulterantes y el control Chuanmutong eran bastante bajos.
Se observó que las huellas dactilares de HPLC de los cinco adulterantes diferían de las muestras auténticas, principalmente en la región con tiempos de retención que oscilaban entre 28 y 55 minutos. El ACP mostró una similitud evidente entre las variedades auténticas y su diferencia con respecto a los adulterantes, excepto por el adulterante CC.También se obtuvieron resultados similares del análisis de conglomerados cuando la distancia de clasificación fue de 20. La matriz de puntuación generada a partir de OPLSDA no indicó intersección entre los puntos de muestra de muestras auténticas y los adulterantes.
Una vez más, el adulterante CC se parecía más a las variedades auténticas que los otros adulterantes. Según el mapa VIP, los picos con valores superiores a uno se identificaron como los principales componentes marcadores que causan la diferencia entre las muestras auténticas y los adulterantes. El contenido de beta-sitosterol, un componente activo encontrado en Chuanmutong se detectó en los cinco lotes de adulterantes, pero el contenido varió mucho.
Este protocolo establece varios métodos de análisis para reflejar toda la información sobre los materiales medicinales desde múltiples ángulos y en todo el camino para estimar la autenticidad de los materiales medicinales Chuanmutong.
