Nuestro protocolo PLA permite identificar y cuantificar la interacción endógena entre proteínas en los sitios de contacto con la membrana. Lo hemos utilizado para estudiar la interacción entre dos proteínas del retículo endoplásmico en los sitios de contacto mitocondrial del retículo endoplásmico. Esta técnica combina el PLA con tinciones de orgánulos y análisis de distancias de orgánulos.
Permite localizar y cuantificar en interacción entre proteínas en los sitios de contacto entre membranas de orgánulos. Después de realizar el ensayo de ligadura de proximidad, o PLA, y la adquisición de imágenes, configure el software de análisis celular para iniciar MATLAB e inicie una extensión haciendo clic en la opción Imaris en el sistema operativo Mac o en el menú de edición en Windows. Seleccione las preferencias, cambie al panel de herramientas personalizadas y establezca la ruta.
Para importar las imágenes en el software, convierta las imágenes de la pila confocal en un archivo IMS, ya sea directamente a través de la sección arena o utilizando el convertidor de archivos independiente que permite la conversión por lotes. Después de la importación, haga clic en editar, vaya a las propiedades de la imagen y seleccione la geometría de la imagen para verificar la calibración de la imagen. Compruebe que el tamaño del vóxel se corresponde con el tamaño de píxel esperado para la imagen real en X e Y, y el paso aplicado por el microscopio para generar la pila Z en Z.To ajustar el contraste de los diferentes canales Haga clic en Editar en el menú, vaya al ajuste de pantalla y seleccione Mostrar ajuste de pantalla.
Ajuste cada canal de forma independiente para optimizar la visualización de cada color. Este paso es esencial para establecer umbrales precisos o detectar objetos débiles. A continuación, haga clic en editar y seleccione recortar 3D para limitar el análisis a una sola celda recortando la imagen.
Para analizar otra celda en el mismo campo de visión, vuelva a abrir la misma imagen y recórtela de forma diferente. Detecte las señales PLA generadas en la ubicación de la interacción de ORP5 y ORP8 haciendo clic en la opción agregar nuevos puntos, que crea un nuevo conjunto de objetos y abre el asistente de detección de puntos. Seleccione el canal en el que se debe realizar la detección puntual.
Ajuste el diámetro XY estimado para ayudar al algoritmo de detección puntual a encontrar los objetos de interés. Si el valor elegido es demasiado alto, los objetos cercanos se fusionarán, y si el valor es demasiado pequeño, se pueden detectar señales aberrantes. Ahora, haga clic en la resta de fondo para eliminar el fondo de la imagen antes de la detección puntual para mejorar el contraste local alrededor de los objetos de interés.
Ajuste el umbral de detección puntual manteniendo la calidad como parámetro de umbral en el umbral automático del software, o modifique ligeramente este valor para detectar todos los objetos. Una vez finalizada la detección puntual, guarde los parámetros de detección y reutilícelos para procesar otras imágenes. A continuación, detecte la red mitocondrial para generar una representación de superficie haciendo clic en añadir nuevas superficies para crear un nuevo objeto y abrir el asistente de detección de superficies.
Seleccione el canal en el que se debe realizar la creación de superficies. Aplique el filtro gaussiano para obtener una superficie más suave haciendo clic en la casilla de verificación suavizar y estableciendo un umbral que indique los detalles menores observables en la superficie. Después, realice una resta de fondo para mejorar los contrastes locales y ajuste el umbral para detectar la red mitocondrial en función de la intensidad de la señal.
Aplique un filtro en la superficie para eliminar pequeños residuos del umbral seleccionando el filtro de número de vóxeles en la ventana de clasificación de superficie y juegue con los umbrales superior e inferior para conservar solo los objetos de interés. Una vez finalizada la creación de la superficie, guarde los parámetros de creación y reutilícelos para procesar otras imágenes. Para generar un mapa de distancia fuera de la superficie mitocondrial creada, seleccione la superficie mitocondrial en el cuadro del árbol de escenas.
Haga clic en procesamiento de imágenes y seleccione la función de superficies, seguida de la transformación de distancia. Aparecerá una extensión de MATLAB en la que se pide al usuario que elija si el mapa debe calcularse fuera o dentro de la superficie del objeto. Seleccione el objeto de la superficie exterior para medir la distancia entre los puntos de PLA y la superficie de las mitocondrias.
Una vez que se genera el mapa, aparece como un nuevo canal en el panel de ajuste de visualización. En este canal, cada píxel tiene un valor correspondiente a la distancia a la mitocondria más cercana. Seleccione los puntos generados previamente en el cuadro del árbol de escenas para medir la distancia desde cada punto a la mitocondria más cercana, e identificar y visualizar los más cercanos.
Ahora, seleccione los valores específicos y la intensidad central del canal correspondiente al mapa de distancia en las estadísticas y el registro detallado para medir el valor de cada centro de punto, que corresponde a su distancia a la mitocondria más cercana en el mapa de distancia. Exporte los datos como un archivo CSV haciendo clic en el icono del disquete en la parte inferior izquierda de la ventana. Para extraer una subpoblación de puntos en función de sus distancias a las mitocondrias, seleccione los puntos en el árbol de escenas y haga clic en la pestaña de filtros.
Agregue un nuevo filtro basado en la intensidad central del canal correspondiente al mapa de distancia en esta ventana y extraiga los puntos a menos de 380 nanómetros de distancia de las mitocondrias estableciendo el umbral inferior en cero micrómetros y el umbral superior en 0,380 micrómetros. Realice un paso de duplicación pulsando el botón duplicar selección a nuevas tintas para enfocar las tintas seleccionadas. Las imágenes confocales del PLA endógeno ORP5-ORP8 mostraron interacciones en las células HeLa en los subdominios reticular RE, RE cortical y RE en estrecho contacto con las mitocondrias, comúnmente conocidas como membranas RE asociadas a mitocondrias.
El análisis de imágenes en 3D reveló que alrededor del 50% de las interacciones endógenas de ORP5-ORP8 PLA se detectaron en las membranas del RE asociadas a las mitocondrias. El porcentaje de interacciones ORP5-ORP8 PLA que ocurren en las membranas del RE asociadas a mitocondrias en células que co-sobreexpresan ORP5 y ORP8 fue similar al observado en células donde estas proteínas se expresaron a niveles endógenos. La regulación negativa de ORP5 y ORP8 indujo una disminución masiva en el número total de señales de PLA, mientras que su co-sobreexpresión aumentó el PLA.
Las señales de PLA se detectaron en las parejas ORP5-PTPIP51 y ORP8-PTPIP51, y sus números promedio fueron similares a los de la pareja ORP5-ORP8 PLA, lo que confirma la localización de ORP5 y ORP8 en los sitios de contacto entre el ER y la membrana mitocondrial. Además, la interacción de ORP5-ORP8 PLA en los contactos de la membrana plasmática del RE en un sitio de contacto de tres vías entre las mitocondrias, el RE y las gotas de lípidos se identifica utilizando células HeLa transfectadas con PHPLCD-RFP o mCherry-PLN1. Como en cualquier método de análisis de imágenes, la calidad de la imagen es un punto clave, por lo que la optimización de la señal es determinante para la detección automática de los objetos.
Esta técnica también se puede utilizar para estudiar las asociaciones entre dos o múltiples orgánulos celulares, como hicimos en nuestro reciente estudio sobre la función de ORP5 y ORP8 en los sitios de contacto de ER, mitocondrias y gotas de lípidos de tres partes. Esta técnica puede ser útil en otros estudios en el campo de la comunicación intracelular para identificar nuevas asociaciones multipartitas entre orgánulos.
