Questo protocollo è un metodo robusto ed economico che può essere utilizzato per affrontare una varietà di domande di ricerca relative alla funzione e al ruolo delle cellule epiteliali delle vie aeree nella salute e nella malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si traduce in uno strato cellulare che è una buona rappresentazione dello strato cellulare epiteliale umano, compresa la produzione di muco e l'attività ciliare. Questa tecnica è versatile e può essere utilizzata per studiare insulti o terapie correlati alla malattia.
Per iniziare, sciacquare l'anello bronchiale isolato dal tessuto polmonare umano con 10 millilitri di PBS sterile in una capsula di Petri di 10 centimetri. Mentre si tiene l'anello con una pinzetta, utilizzare piccole forbici per rimuovere eventuali residui di tessuto connettivo e sangue in eccesso. Tagliare l'anello in due e immergere due metà in 10 millilitri di soluzione preriscaldata di proteasi 14 in HBSS contenente Primocin in un contenitore sterile chiuso.
Incubare i pezzi dell'anello bronchiale a 37 gradi Celsius per due ore. Dopo l'incubazione, trasferire i pezzi in una capsula di Petri contenente 10 millilitri di PBS caldo e, utilizzando una pinzetta piegata, raschiare l'interno dell'anello per ottenere una soluzione cellulare. Scartare l'anello.
Trasferire la soluzione cellulare in un tubo da 50 millilitri e aggiungere PBS caldo per ottenere un volume finale di 50 millilitri. Centrifugare la soluzione cellulare e aspirare il surnatante prima di risospendere il pellet in 10 millilitri di PBS caldo. Portare il volume a 50 millilitri con PBS e ripetere la centrifugazione.
Risospendere il pellet in KSFM completo caldo contenente Primocin. Quindi, sostituire la soluzione di rivestimento dalla piastra a sei pozzetti con due millilitri di sospensione cellulare per pozzetto. Lasciare che le cellule crescano fino a raggiungere l'80-90% di confluenza, Per la crioconservazione dei PBEC, aspirare il mezzo dai pozzetti e lavare le cellule una volta con due millilitri di PBS caldo per pozzetto.
Tripsinizzare le cellule aggiungendo 500 microlitri di tripsina morbida per pozzetto e incubare per cinque a 10 minuti a 37 gradi Celsius. Ruotare la soluzione di tripsina e rilasciare le cellule picchiettando delicatamente la piastra. Trasferire le cellule staccate in una provetta da centrifuga da 50 millilitri contenente inibitore della tripsina della soia.
Centrifugare la sospensione e scartare il surnatante prima di sospendere nuovamente il pellet in 10 millilitri di KSFM contenente penicillina e streptomicina. Dopo aver contato le cellule su un contatore automatico delle cellule, risospendere le cellule a una concentrazione di 400.000 cellule per millilitro in un mezzo di congelamento e aggiungere un millilitro di questa sospensione in un crioviale. Trasferire i flaconcini in un contenitore di celle fredde e posizionarlo a meno 80 gradi Celsius.
Dopo 24 ore, trasferire i flaconcini a meno 196 gradi Celsius azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Per rivestire un pallone di coltura cellulare T75, aggiungere 10 millilitri di soluzione di rivestimento in PBS e chiudere bene il coperchio prima di posizionare il pallone in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, sostituire la soluzione di rivestimento dal pallone con 10 millilitri di KSFM completo.
Lasciare riscaldare il mezzo a 37 gradi Celsius nell'incubatore con un coperchio leggermente aperto per far entrare l'incubatrice. Scongelare rapidamente i PBEC crioconservati in un bagno di perline a 37 gradi Celsius. Aggiungere l'intero contenuto al crioviale al pallone T75 preriscaldato e distribuire uniformemente le cellule.
Dopo essersi assicurati che le cellule siano saldamente attaccate, sostituire il mezzo con 10 millilitri di KSFM completo fresco e caldo e farli crescere fino a raggiungere l'80-90% di confluenza. Rivestire gli inserti di coltura cellulare aggiungendo 400 microlitri di soluzione di rivestimento per inserto e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Tripsinizzare i PBEC nel pallone aggiungendo due millilitri di tripsina morbida e incubare per cinque a 10 minuti.
Facilitare il distacco delle cellule ruotando e picchiettando delicatamente il pallone. Quindi, aggiungere quattro millilitri di inibitore della tripsina di soia al pallone e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 25 millilitri. Centrifugare la sospensione e risospendere il pellet in sei millilitri di mezzo BD completo.
Contare le celle su un contatore di celle automatico. Dopo il rivestimento, rimuovere la soluzione di rivestimento dagli inserti. Diluire la sospensione cellulare con mezzo BD completo integrato con una nanomole EC 23 e aggiungere 500 microlitri sulla parte superiore della membrana degli inserti.
Aggiungere 1,5 millilitri di mezzo BD completo al pozzetto sotto l'inserto. Quando le celle sono pronte per il trasferimento all'interfaccia aria-liquido, o ALI, rimuovere il mezzo dagli inserti e dal pozzetto e aggiungere nuovo mezzo BD completo integrato con 50 nanomolari EC 23 solo al pozzo. Cambia il mezzo nei pozzetti tre volte a settimana.
Per rimuovere il muco in eccesso e i detriti cellulari, aggiungere delicatamente 200 microlitri di PBS caldo sul lato apicale dello strato cellulare all'interno dell'inserto e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'incubazione, aspirare il PBS contenente muco in eccesso e detriti cellulari. TEER è stato misurato per valutare la qualità delle colture ALI PBEC.
A sette giorni, la resistenza elettrica dello strato cellulare superiore a 300 ohm è considerata una coltura di successo. Inoltre, la variabilità inter-donatore nella resistenza elettrica si è ridotta nel tempo tra il settimo giorno e il giorno 14 della coltura presso l'interfaccia aria-liquido ed è marcatamente influenzata dall'origine del DMEM utilizzato. Tutti i principali tipi di cellule, come basali, ciliate, calici e cellule club, sono stati osservati dopo 14 giorni di coltura ALI e i livelli di espressione erano dipendenti dal donatore.
Tra le diverse concentrazioni di EC 23 testate, è stato osservato un TEER massimo a 50 nanomolari. Un confronto tra l'acido retinoico e il suo analogo sintetico, EC 23, conferma che l'espressione genica dei marcatori per le cellule ciliate e caliciformi era simile tra 50 nanomolari EC 23 e acido retinoico. L'utilizzo di terreni di diversi fornitori ha comportato differenze sostanziali nella composizione cellulare, mentre le differenze nel TEER erano meno pronunciate.
D'altra parte, l'utilizzo di inserti di fornitori diversi non ha comportato differenze sostanziali nella decomposizione cellulare. Inoltre, è stata osservata anche una differenza nei valori di TEER e nella composizione cellulare del mezzo ALI PBEC e PneumaCult rispetto al mezzo BD completo. Quando le cellule sono pronte per il trasferimento in ALI, aumentare le concentrazioni di EC 23.
Inoltre, non centrifugare le cellule dopo lo scongelamento e rimuovere rapidamente le cellule dalla plastica di coltura cellulare dopo l'aggiunta di SBTI. Utilizzando colture di cellule epiteliali delle vie aeree nel modo previsto in questo protocollo, è possibile seguirlo utilizzando una varietà di metodi di analisi per esaminare, ad esempio, la funzione, l'espressione genica, la produzione di mediatori delle cellule epiteliali delle vie aeree e quindi, ad esempio, ottenere informazioni sulle conseguenze dell'esposizione, ad esempio, al fumo di sigaretta. I prossimi passi per questo protocollo di coltura cellulare è l'integrazione di ulteriori tipi di cellule, come le cellule immunitarie o le cellule vascolari, e questo contribuirà ad aumentare la rappresentazione tissutale.
