Этот протокол предназначен для надежного и экономически эффективного метода, который может быть использован для решения различных исследовательских вопросов, связанных с функцией и ролью эпителиальных клеток дыхательных путей в здоровье и болезнях. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он приводит к образованию клеточного слоя, который хорошо отражает слой эпителиальных клеток человека, включая выработку слизи и цилиарную активность. Этот метод универсален и может быть использован для изучения связанных с болезнью травм или методов лечения.
Для начала промойте бронхиальное кольцо, выделенное из легочной ткани человека, 10 миллилитрами стерильного PBS в 10-сантиметровой чашке Петри. Удерживая кольцо пинцетом, используйте маленькие ножницы, чтобы удалить лишнюю соединительную ткань и остатки крови. Разрежьте кольцо на две части и погрузите две половинки в 10 миллилитров предварительно подогретого раствора протеазы 14 в HBSS, содержащем примоцин, в закрытом стерильном контейнере.
Инкубируйте кусочки бронхиального кольца при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. После инкубации переложите кусочки в чашку Петри, содержащую 10 миллилитров теплого PBS, и с помощью согнутого пинцета соскребите внутреннюю часть кольца для получения клеточного раствора. Выбросьте кольцо.
Перелейте клеточный раствор в пробирку объемом 50 миллилитров и добавьте теплый PBS, чтобы получить конечный объем 50 миллилитров. Центрифугируйте клеточный раствор и аспирируйте надосадочную жидкость перед повторным суспендированием гранулы в 10 миллилитрах теплого PBS. Доведите объем до 50 миллилитров с помощью PBS, и повторите центрифугирование.
Повторно суспендируйте гранулы в теплом комплекте KSFM, содержащем примоцин. Затем замените раствор покрытия из шестилуночной пластины двумя миллилитрами клеточной суспензии на лунку. Дайте клеткам расти до тех пор, пока не будет достигнуто слияние от 80 до 90%, Для криоконсервации PBEC аспирируйте среду из лунок и промойте клетки один раз двумя миллилитрами теплого PBS на лунку.
Трипсинизируйте клетки, добавляя 500 микролитров мягкого трипсина в лунку, и инкубируйте в течение пяти-10 минут при температуре 37 градусов по Цельсию. Взболтайте раствор трипсина и освободите клетки, осторожно постукивая по пластине. Перенесите отделившиеся клетки в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую ингибитор трипсина сои.
Центрифугируйте суспензию и выбросьте надосадочную жидкость перед повторной суспендированием гранулы в 10 миллилитрах KSFM, содержащего пенициллин и стрептомицин. После подсчета клеток на автоматизированном счетчике клеток повторно суспендируйте клетки до концентрации 400 000 клеток на миллилитр в замораживающей среде и добавьте один миллилитр этой суспензии в криовальную систему. Переложите флаконы в прохладный контейнер для клеток и поместите его при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Через 24 часа переложите флаконы на жидкий азот при температуре минус 196 градусов Цельсия для длительного хранения. Чтобы покрыть колбу для клеточной культуры T75, добавьте 10 миллилитров раствора покрытия в PBS и плотно закройте крышку, прежде чем поместить колбу в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день замените раствор покрытия из колбы на 10 миллилитров полного КСФМ.
Дайте среде нагреться до 37 градусов по Цельсию в инкубаторе со слегка приоткрытой крышкой, чтобы инкубатор проветрился. Быстро разморозьте криоконсервированные PBEC в ванне с шариками при температуре 37 градусов Цельсия. Добавьте все содержимое криовиала в предварительно разогретую колбу Т75 и равномерно распределите ячейки.
Убедившись, что ячейки прочно прикреплены, замените среду 10 миллилитрами свежего и теплого полного KSFM и выращивайте их до тех пор, пока не будет достигнуто слияние от 80 до 90%. Покройте вставки для клеточных культур, добавив 400 микролитров раствора покрытия на вкладыш, и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Трипсинизируйте PBEC в колбе, добавив два миллилитра мягкого трипсина, и инкубируйте в течение пяти-10 минут.
Облегчите отслоение клеток, вращая и осторожно постукивая по колбе. Затем добавьте в колбу четыре миллилитра ингибитора трипсина сои и перенесите клеточную суспензию в 25-миллилитровую пробирку. Центрифугируют суспензию и повторно суспендируют гранулы в шести миллилитрах полной среды BD.
Подсчитайте количество ячеек на автоматическом счетчике ячеек. После нанесения покрытия удалите раствор покрытия со вставок. Разбавьте клеточную суспензию полной средой BD, дополненной одним наномолем EC 23, и добавьте 500 микролитров в верхнюю часть мембраны вставок.
Добавьте 1,5 миллилитра полной среды BD в лунку под вкладышем. Когда ячейки будут готовы к переносу на границу раздела воздух-жидкость, или ALI, удалите среду из вставок и лунки и добавьте новую полную среду BD, дополненную 50 наномолярным EC 23, только в лунку. Меняйте среду в лунках трижды в неделю.
Чтобы удалить излишки слизи и клеточного мусора, аккуратно добавьте 200 микролитров теплого PBS на апикальную сторону клеточного слоя внутри вкладыша и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. После инкубации аспирируйте PBS, содержащий избыток слизи и клеточного мусора. TEER был измерен для оценки качества культур ALI PBEC.
Через семь дней электрическое сопротивление слоя ячейки выше 300 Ом считается успешной культурой. Кроме того, междонорская изменчивость электрического сопротивления снижалась с течением времени между седьмым и 14-м днями культивирования на границе раздела воздух-жидкость и заметно зависела от происхождения используемого DMEM. Все основные различные типы клеток, такие как базальные, реснитчатые, бокаловидные и клубные клетки, наблюдались в течение 14 дней культивирования ALI, и уровни экспрессии зависели от донора.
Среди различных концентраций тестируемого EC 23 максимальный TEER наблюдался при 50 наномолярах. Сравнение ретиноевой кислоты и ее синтетического аналога EC 23 подтверждает, что экспрессия генов маркеров реснитчатых и бокаловидных клеток была одинаковой между 50 наномолярными EC 23 и ретиноевой кислотой. Использование среды от разных поставщиков привело к существенным различиям в клеточном составе, тогда как различия в TEER были менее выражены.
С другой стороны, использование вставок от разных поставщиков не привело к существенным различиям в клеточном разложении. Кроме того, также наблюдалась разница в значениях TEER и клеточном составе ALI PBEC и среды PneumaCult по сравнению с полной средой BD. Когда клетки будут готовы к переводу в ALI, увеличьте концентрацию EC 23.
Кроме того, не центрифугируйте клетки после размораживания и быстро удаляйте клетки из пластика клеточных культур после добавления SBTI. Используя культуры эпителиальных клеток дыхательных путей, как это предусмотрено в этом протоколе, вы можете следить за этим, используя различные методы анализа, чтобы посмотреть, например, на функцию, экспрессию генов, производство медиаторов эпителиальных клеток дыхательных путей и, таким образом, например, получить представление о последствиях воздействия, например, сигаретного дыма. Следующими шагами для этого протокола клеточных культур является интеграция дополнительных типов клеток, таких как иммунные клетки или сосудистые клетки, и это поможет увеличить представительство тканей.
