Este protocolo é um método robusto e custo-efetivo que pode ser usado para abordar uma variedade de questões de pesquisa relacionadas à função e ao papel das células epiteliais das vias aéreas na saúde e na doença. A principal vantagem dessa técnica é que ela resulta em uma camada celular que representa bem a camada de células epiteliais humanas, incluindo a produção de muco e a atividade ciliar. Esta técnica é versátil e pode ser usada para estudar insultos relacionados a doenças, ou terapias.
Para começar, lave o anel brônquico isolado do tecido pulmonar humano com 10 mililitros de PBS estéril em uma placa de Petri de 10 centímetros. Ao segurar o anel com uma pinça, use uma tesoura pequena para remover qualquer excesso de tecido conjuntivo e restos de sangue. Corte o anel em dois e submerja duas metades em 10 mililitros de solução pré-aquecida de Protease 14 em HBSS contendo Primocina em um recipiente estéril fechado.
Incubar os anéis brônquicos a 37 graus Celsius por duas horas. Após a incubação, transfira as peças para uma placa de Petri contendo 10 mililitros de PBS quente e, usando uma pinça dobrada, raspe o interior do anel para obter uma solução celular. Descarte o anel.
Transfira a solução celular para um tubo de 50 mililitros e adicione PBS quente para obter um volume final de 50 mililitros. Centrifugar a solução celular e aspirar o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em 10 mililitros de PBS quente. Completar o volume para 50 mililitros com PBS e repetir a centrifugação.
Ressuspenda o pellet em KSFM completo aquecido contendo Primocin. Em seguida, substitua a solução de revestimento da placa de seis poços por dois mililitros de suspensão celular por poço. Permitir que as células cresçam até que 80 a 90% de confluência seja alcançada, Para criopreservação de PBECs, aspirar o meio dos poços e lavar as células uma vez com dois mililitros de PBS quente por poço.
Tripsinize as células adicionando 500 microlitros de tripsina mole por poço e incube por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius. Agite a solução de tripsina e solte as células batendo suavemente na placa. Transfira as células destacadas para um tubo centrífugo de 50 mililitros contendo inibidor de tripsina de soja.
Centrifugar a suspensão e descartar o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em 10 mililitros de KSFM contendo penicilina e estreptomicina. Depois de contar as células em um contador de células automatizado, ressuspenda as células para uma concentração de 400.000 células por mililitro em um meio de congelamento e adicione um mililitro dessa suspensão em um criovial. Transfira os frascos para injetáveis para um recipiente de células frescas e coloque-o a 80 graus Celsius negativos.
Após 24 horas, transfira os frascos para nitrogênio líquido de 196 graus Celsius negativos para armazenamento a longo prazo. Para revestir um balão de cultura de células T75, adicionar 10 mililitros de solução de revestimento em PBS e fechar bem a tampa antes de colocar o balão numa incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, substituir a solução de revestimento do frasco por 10 mililitros de KSFM completo.
Deixe o meio aquecer a 37 graus Celsius na incubadora com uma tampa ligeiramente aberta para deixar o ar da incubadora entrar. Descongele rapidamente os PBECs criopreservados em um banho de contas de 37 graus Celsius. Adicionar todo o conteúdo ao criovial ao frasco T75 pré-aquecido e distribuir as células uniformemente.
Depois de garantir que as células estão firmemente ligadas, substitua o meio por 10 mililitros de KSFM completo fresco e quente e cresça-as até atingir 80 a 90% de confluência. Revestir as pastilhas de cultura de células adicionando 400 microlitros de solução de revestimento por pastilha e incubar durante a noite a 37 graus Celsius. Tripsinizar os PBECs no balão adicionando dois mililitros de tripsina mole e incubar por cinco a 10 minutos.
Facilite o descolamento das células girando e batendo suavemente o frasco. Em seguida, adicionar quatro mililitros de inibidor de tripsina de soja ao balão e transferir a suspensão celular para um tubo de 25 mililitros. Centrifugar a suspensão e ressuspender o pellet em seis mililitros de meio BD completo.
Conte as células em um contador de células automatizado. Após o revestimento, remova a solução de revestimento das pastilhas. Diluir a suspensão celular com meio BD completo suplementado com um nanomole EC 23 e adicionar 500 microlitros no topo da membrana das pastilhas.
Adicione 1,5 mililitros de BD completo ao poço abaixo da pastilha. Quando as células estiverem prontas para transferência para a Interface Ar-Líquido, ou ALI, remova o meio das inserções e do poço e adicione novo meio BD completo suplementado com 50 nanomolares EC 23 apenas ao poço. Troque o meio nos poços três vezes por semana.
Para remover o excesso de muco e detritos celulares, adicione suavemente 200 microlitros de PBS quente no lado apical da camada celular dentro da inserção e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após a incubação, aspirar o PBS contendo excesso de muco e restos celulares. O TEER foi medido para avaliar a qualidade das culturas de LPA-PBEC.
Aos sete dias, a resistência elétrica da camada celular superior a 300 ohms é considerada uma cultura de sucesso. Além disso, a variabilidade interdoadores na resistência elétrica reduziu ao longo do tempo entre o sétimo e o 14º dia de cultura na Interface Ar-Líquido, e é marcadamente influenciada pela origem do DMEM utilizado. Todos os principais tipos celulares diferentes, como basais, ciliados, caliciformes e club, foram observados após 14 dias de cultura de LPA, e os níveis de expressão foram doador-dependentes.
Entre as diferentes concentrações de EC 23 testadas, o TEER máximo foi observado em 50 nanomolares. Uma comparação entre o ácido retinóico e seu análogo sintético, EC 23, confirma que a expressão gênica de marcadores para células ciliadas e caliciformes foi semelhante entre EC 23 nanomolar 50 e ácido retinóico. O uso de meios de diferentes fornecedores resultou em diferenças substanciais na composição celular, enquanto as diferenças no TEER foram menos pronunciadas.
Por outro lado, o uso de insertos de diferentes fornecedores não resultou em diferenças substanciais na decomposição celular. Além disso, também foi observada diferença nos valores de TEER e na composição celular do PBEC da LPA e do meio PneumaCult em relação ao meio BD completo. Quando as células estiverem prontas para serem transferidas para a LPA, aumente as concentrações de EC 23.
Além disso, não centrifugar as células após o descongelamento e remover rapidamente as células de plásticos de cultura celular após a adição de SBTI. Usando culturas de células epiteliais das vias aéreas da maneira fornecida neste protocolo, você pode acompanhar isso usando uma variedade de métodos de análise para analisar, por exemplo, a função, a expressão gênica, a produção de mediadores das células epiteliais das vias aéreas e, assim, por exemplo, obter informações sobre as consequências de exposições a, por exemplo, fumaça de cigarro. Os próximos passos para este protocolo de cultura celular é a integração de tipos celulares adicionais, como células imunes, ou células vasculares, e isso ajudará a aumentar a representação tecidual.
