このプロトコルは、健康と病気における気道上皮細胞の機能と役割に関連するさまざまな研究課題に対処するために使用できる、堅牢で費用効果の高い方法のためのものです。この技術の主な利点は、粘液産生や繊毛活動など、ヒト上皮細胞層をよく表した細胞層が得られることです。この手法は用途が広く、病気に関連する侮辱や治療法の研究に使用できます。
はじめに、ヒト肺組織から単離された気管支リングを10センチメートルのペトリ皿で10ミリリットルの滅菌PBSですすぎます。ピンセットでリングを持ちながら、小さなハサミを使用して余分な結合組織と血液の残りを取り除きます。リングを2つに切断し、密閉滅菌容器内のプリモシンを含むHBSS中の10ミリリットルの予熱したプロテアーゼ14溶液に2つの半分を沈めます。
気管支リングピースを摂氏37度で2時間インキュベートします。インキュベーション後、小片を10ミリリットルの温かいPBSを含むシャーレに移し、曲がったピンセットを使用してリングの内側をこすり、細胞溶液を得る。リングを破棄します。
細胞溶液を50ミリリットルのチューブに移し、温かいPBSを加えて50ミリリットルの最終容量を得る。細胞溶液を遠心分離し、ペレットを10ミリリットルの温かいPBSに再懸濁する前に上清を吸引した。PBSで容量を50ミリリットルに作り、遠心分離を繰り返します。
ペレットをプリモシンを含む温かい完全なKSFMに再懸濁します。次に、6ウェルプレートからのコーティング溶液を1ウェルあたり2ミリリットルの細胞懸濁液と交換する。80〜90%のコンフルエンシーに達するまで細胞を増殖させ、PBECの凍結保存のために、ウェルから培地を吸引し、ウェルあたり2ミリリットルの温かいPBSで細胞を1回洗浄します。
ウェルあたり500マイクロリットルのソフトトリプシンを加えて細胞をトリプシン化し、摂氏37度で5〜10分間インキュベートします。トリプシン溶液を旋回させ、プレートを軽くたたいて細胞を放出します。剥離した細胞を大豆トリプシン阻害剤を含む50ミリリットルの遠沈管に移します。
懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄してから、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む10ミリリットルのKSFMにペレットを再懸濁する。自動セルカウンターで細胞を計数した後、凍結培地中に細胞を1ミリリットル当たり400, 000細胞の濃度に再懸濁し、そしてこの懸濁液を1ミリリットルクライオバイアルに加える。バイアルを冷たいセル容器に移し、摂氏マイナス80度に置きます。
24時間後、バイアルをマイナス196°Cの液体窒素に移して長期保存します。T75細胞培養フラスコをコーティングするには、PBSに10ミリリットルのコーティング溶液を加え、蓋をしっかりと閉めてから、フラスコを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに入れます。翌日、フラスコからのコーティング溶液を10ミリリットルの完全なKSFMと交換します。
インキュベーター内の培地を37°Cに温め、蓋を少し開いてインキュベーターに空気を入れます。凍結保存されたPBECを摂氏37度のビーズバスですばやく解凍します。予め温めたT75フラスコにクライオバイアルの内容物全体を加え、細胞を均等に分配します。
細胞がしっかりと付着していることを確認した後、培地を10ミリリットルの新鮮で温かい完全なKSFMと交換し、80〜90%のコンフルエンシーに達するまで増殖させます。インサートあたり400マイクロリットルのコーティング溶液を加えて細胞培養インサートをコートし、摂氏37度で一晩インキュベートします。2ミリリットルのソフトトリプシンを加えてフラスコ内のPBECをトリプシン化し、5〜10分間インキュベートします。
フラスコを旋回させて軽くたたくことにより、細胞の剥離を促進します。次に、4ミリリットルの大豆トリプシン阻害剤をフラスコに加え、細胞懸濁液を25ミリリットルのチューブに移す。懸濁液を遠心分離し、ペレットを6ミリリットルの完全BD培地に再懸濁します。
自動セルカウンターでセルをカウントします。コーティング後、インサートからコーティング液を取り除きます。1ナノモルのEC23を添加した完全BD培地で細胞懸濁液を希釈し、インサートの膜の上部に500マイクロリットルを加えます。
1.5ミリリットルの完全なBD培地をインサートの下のウェルに追加します。細胞を気液界面(ALI)に移す準備ができたら、インサートとウェルから培地を取り出し、50ナノモルのEC 23を添加した新しい完全なBD培地をウェルにのみ追加します。ウェル内の培地を週に3回交換してください。
余分な粘液や細胞の破片を取り除くには、インサート内の細胞層の頂端側に200マイクロリットルの温かいPBSをそっと加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。インキュベーション後、過剰な粘液および細胞破片を含むPBSを吸引する。TEERを測定して、ALI PBEC培養物の品質を評価した。
7日目に、300オームを超える細胞層の電気抵抗は成功した培養と見なされます。さらに、気液界面での培養の7日目から14日目までの電気抵抗のドナー間変動性は経時的に減少し、使用されるDMEMの起源によって著しく影響を受ける。基底細胞、繊毛細胞、杯細胞、クラブ細胞などの主要な異なる細胞タイプはすべて、ALI培養の14日目に観察され、発現レベルはドナーに依存していました。
試験したEC 23の異なる濃度の中で、最大TEERは50ナノモルで観察された。レチノイン酸とその合成類似体であるEC23の比較により、繊毛細胞および杯細胞に対するマーカーの遺伝子発現は、50ナノモルのEC23とレチノイン酸の間で類似していたことが確認される。異なる供給業者の培地を使用すると、細胞組成に大きな違いが生じましたが、TEERの違いはそれほど顕著ではありませんでした。
一方、異なるサプライヤーのインサートを使用しても、細胞分解に大きな違いはありませんでした。また、ALI PBECおよびニューマカルト培地のTEER値および細胞組成に、完全BD培地と比較して差も観察された。細胞をALIに移行する準備ができたら、EC 23濃度を上げます。
また、融解後の細胞は遠心分離せず、SBTI添加後速やかに細胞培養プラスチックから細胞を除去した。このプロトコルで提供されている方法で気道上皮細胞の培養を使用すると、さまざまな分析方法を使用して追跡し、たとえば、気道上皮細胞の機能、遺伝子発現、メディエーター産生を調べ、たとえば、タバコの煙への曝露の結果についての洞察を得ることができます。この細胞培養プロトコルの次のステップは、免疫細胞や血管細胞などの追加の細胞タイプの統合であり、これは組織の表現を増やすのに役立ちます。
