פרוטוקול זה מיועד לשיטה חזקה וחסכונית שניתן להשתמש בה כדי לענות על מגוון שאלות מחקר הקשורות לתפקוד ולתפקיד של תאי אפיתל בדרכי הנשימה בבריאות ובמחלות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יוצרת שכבת תא המייצגת היטב את שכבת תאי האפיתל האנושית, כולל ייצור ריר ופעילות ריסנית. טכניקה זו היא תכליתית וניתן להשתמש בה כדי לחקור עלבונות הקשורים למחלה, או טיפולים.
כדי להתחיל, לשטוף את טבעת הסימפונות מבודד מרקמת הריאה האנושית עם 10 מיליליטר של PBS סטרילי בצלחת פטרי 10 ס"מ. בזמן שאתם מחזיקים את הטבעת בפינצטה, השתמשו במספריים קטנים כדי להסיר עודפי רקמת חיבור ושאריות דם. חותכים את הטבעת לשניים, וטובלים שני חצאים ב-10 מיליליטר של תמיסת פרוטאז 14 שחוממה מראש ב-HBSS המכילה פרימוצין במיכל סטרילי סגור.
לדגור על חתיכות טבעת הסימפונות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר הדגירה, מעבירים את החתיכות לצלחת פטרי המכילה 10 מיליליטר PBS חם, ובעזרת פינצטה כפופה, מגרדים את החלק הפנימי של הטבעת כדי לקבל תמיסת תאים. השליכו את הטבעת.
העבר את תמיסת התא לצינור 50 מיליליטר, והוסף PBS חם לקבלת נפח סופי של 50 מיליליטר. צנטריפוגו את תמיסת התא, ושאפו את הסופרנאטנט לפני שתשהו מחדש את הגלולה ב -10 מיליליטר של PBS חם. לפצות את נפח ל 50 מיליליטר עם PBS, ולחזור על הצנטריפוגה.
יש להשהות מחדש את הגלולה ב-KSFM חם ושלם המכיל פרימוצין. לאחר מכן, להחליף את פתרון ציפוי מן צלחת שש בארות עם שני מיליליטר של השעיית התא לכל באר. לאפשר לתאים לגדול עד 80 עד 90% מפגש הוא הגיע, עבור cryopreservation של PBECs, לשאוף את התווך מן הבארות ולשטוף את התאים פעם אחת עם שני מיליליטר של PBS חם לכל באר.
טריפסינזציה של התאים על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של טריפסין רך לכל באר, ודגרה במשך חמש עד 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מערבלים את תמיסת הטריפסין, ומשחררים את התאים על ידי הקשה עדינה על הצלחת. מעבירים את התאים המנותקים לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר המכיל מעכב טריפסין מפולי סויה.
צנטריפוגות את המתלים, ומשליכים את הסופרנאטנט לפני השעיית הגלולה מחדש ב-10 מיליליטר של KSFM המכיל פניצילין וסטרפטומיצין. לאחר ספירת התאים על מונה תאים אוטומטי, להשעות מחדש את התאים לריכוז של 400, 000 תאים למיליליטר בתווך הקפאה, ולהוסיף מיליליטר אחד של השעיה זו בהקפאה. מעבירים את הבקבוקונים למיכל תא קריר, ומניחים אותו על מינוס 80 מעלות צלזיוס.
לאחר 24 שעות, העבירו את הבקבוקונים למינוס 196 מעלות צלזיוס חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. כדי לצפות בקבוק תרבית תאים T75, הוסיפו 10 מיליליטר של תמיסת ציפוי ב-PBS, וסגרו את המכסה היטב לפני הנחת הבקבוק באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת, להחליף את פתרון ציפוי מן הבקבוק עם 10 מיליליטר של KSFM מלא.
מניחים למדיום להתחמם ל-37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם מכסה פתוח מעט כדי לאפשר לאינקובטור להתאוורר פנימה. הפשירו במהירות את ה-PBECs השמורים בהקפאה באמבט חרוזים של 37 מעלות צלזיוס. הוסף את כל התוכן לקריוביאל לבקבוק T75 שחומם מראש ופזר את התאים באופן שווה.
לאחר וידוא כי התאים מחוברים היטב, להחליף את המדיום עם 10 מיליליטר של KSFM שלם טרי וחם, ולגדל אותם עד 80 עד 90% מפגש הוא הגיע. תרבית תאי מעיל תוספות על ידי הוספת 400 מיקרוליטר של תמיסת ציפוי לכל תוספת, ולדגור במשך הלילה ב 37 מעלות צלזיוס. טריפסינזציה של PBECs בבקבוק על ידי הוספת שני מיליליטר של טריפסין רך, ולדגור במשך חמש עד 10 דקות.
הקל על ניתוק התאים על ידי ערבול והקשה עדינה על הצלוחית. לאחר מכן, להוסיף ארבעה מיליליטר של מעכב טריפסין סויה לצלוחית, ולהעביר את השעיית התא צינור 25 מיליליטר. צנטריפוגה את המתלים ולתלות מחדש את הגלולה בשישה מיליליטר של מדיום BD מלא.
ספור את התאים במונה תאים אוטומטי. לאחר הציפוי, הסר את תמיסת הציפוי מהתוספות. לדלל את תרחיף התא עם מדיום BD מלא בתוספת ננומול EC 23 אחד ולהוסיף 500 מיקרוליטר על החלק העליון של הממברנה של תוספות.
הוסף 1.5 מיליליטר של מדיום BD שלם לבאר שמתחת לתוספת. כאשר התאים מוכנים להעברה לממשק אוויר-נוזל, או ALI, הסר את התווך מהתוספות ומהבאר, והוסף מדיום BD שלם חדש בתוספת EC 23 50 ננו-מולרי רק לבאר. לשנות את המדיום בבארות שלוש פעמים בשבוע.
כדי להסיר עודפי ריר ופסולת תאית, הוסיפו בעדינות 200 מיקרוליטר של PBS חם בצד האפי של שכבת התא בתוך העלון, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר הדגירה, שואפים PBS המכיל עודף ריר ופסולת תאית. TEER נמדד כדי להעריך את האיכות של תרבויות PBEC ALI.
בגיל שבעה ימים, ההתנגדות החשמלית של שכבת התא הגבוהה מ -300 אוהם נחשבת לתרבית מוצלחת. יתר על כן, השונות בין התורמים בהתנגדות החשמלית פחתה עם הזמן בין היום השביעי ליום ה-14 של התרבית בממשק אוויר-נוזל, והיא מושפעת במידה ניכרת ממקור ה-DMEM בו נעשה שימוש. כל סוגי התאים העיקריים, כגון תאי בסיס, ריסון, גביע וקלאב, נצפו לאחר 14 יום של תרבית ALI, ורמות הביטוי היו תלויות בתורם.
בין הריכוזים השונים של EC 23 שנבדק, TEER מקסימלי נצפה ב 50 ננומולארי. השוואה בין חומצה רטינואית לבין האנלוגיה הסינתטית שלה, EC 23, מאשרת כי ביטוי גנים של סמנים עבור תאים ciliated ו goblet היו דומים בין 50 ננומולרי EC 23 וחומצה רטינואית. השימוש בתווך מספקים שונים הביא להבדלים משמעותיים בהרכב הסלולר, בעוד שההבדלים ב-TEER היו פחות בולטים.
לעומת זאת, שימוש באינווסטים מספקים שונים לא הביא להבדלים מהותיים בפירוק התאים. יתר על כן, נצפה גם הבדל בערכי TEER ובהרכב התאי של PBEC ALI ומדיום PneumaCult בהשוואה למדיום BD השלם. כאשר התאים מוכנים לעבור ל- ALI, הגדל את ריכוזי EC 23.
כמו כן, אין לבצע צנטריפוגות של התאים לאחר ההפשרה, ולהסיר במהירות את התאים מפלסטיק תרבית תאים לאחר הוספת SBTI. באמצעות תרביות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה כפי שמופיע בפרוטוקול זה, ניתן לעקוב אחר כך באמצעות מגוון שיטות ניתוח כדי להסתכל, למשל, על הפונקציה, ביטוי הגנים, ייצור המתווך של תאי האפיתל של דרכי הנשימה, וכך, למשל, לקבל תובנה לגבי ההשלכות של חשיפות, למשל, לעשן סיגריות. השלבים הבאים בפרוטוקול תרבית תאים זה הם שילוב של סוגי תאים נוספים, כגון תאי מערכת החיסון, או תאי כלי דם, וזה יעזור להגדיל את ייצוג הרקמות.
