Biomoleküle unterliegen kleinen und schnellen strukturellen Veränderungen, oft als Reaktion auf Krafteinwirkungen. Hochauflösende magnetische Pinzetten können diese Dynamik unter physiologisch relevanten Kräften erforschen. Da die Methode nanoskalige Messungen mit einer Genauigkeit von Millisekunden durchführt, ist es möglich, subtile Veränderungen von Nukleinsäuren und Proteinen in Echtzeit zu überwachen.
Fehlfunktionen von ersttragenden und mechanosensitiven Proteinen können potenziell zu Herz-Kreislauf- und Muskel-Skelett-Erkrankungen führen. Eine magnetische Pinzette kann Aufschluss über die Wirkmechanismen dieser Proteine geben. Das Set muss richtig ausgerichtet und kalibriert sein, um gute Auflösungen zu erhalten.
Auch bei der Vorbereitung und Identifizierung von molekularen Konstrukten für Messungen ist Vorsicht geboten. Beginnen Sie damit, ein inverses Mikroskop auf einem schwingungsdämpfenden optischen Tisch aufzustellen. Installieren Sie als Nächstes eine Hochgeschwindigkeits-CMOS-Kamera und einen Framegrabber.
Montieren Sie einen motorisierten Lineartisch mit mehr als 20 Millimetern Verfahrweg vertikal auf einem manuellen XY-Tisch, um einen Translationstisch für die Magnetmanipulation in 3D zu bauen. Installieren Sie als Nächstes einen rotierenden Schrittmotor und ein Riemen- und Riemenscheibensystem für die Magnetrotation. Montieren Sie die Magnete auf einer Acrylhalterung, in der die identischen parallelen Magnete einen Millimeter voneinander entfernt sind.
Passen Sie die vertikale Position des Translationstages so an, dass die Unterseite des Magneten mit der Probenebene an der niedrigsten Tischposition ausgerichtet ist. Richten Sie die Magnete mit einer Objektivlinse mit geringer Vergrößerung in der Mitte des Sichtfelds aus. Überprüfen Sie die Magnetdrehung, um sicherzustellen, dass die Verschiebung der Mitte des Magnetpaares begrenzt ist.
Installieren Sie eine Superlumineszenzdiode für die Perlenbeleuchtung. Führen Sie den Strahl durch den Magnetspalt und stellen Sie sicher, dass der Strahl richtig kollimiert ist, um in den Spalt zu passen, und die Beleuchtung nicht von den Magneten abgeschattet wird. Installieren Sie nun einen Piezo-Linsenscanner am Nasenstück und montieren Sie ein 100-faches Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,5 für die Perlenverfolgung.
Stellen Sie sicher, dass die Beleuchtung gleichmäßig mit der Magnetbewegung übereinstimmt, um mögliche Artefakte bei der Perlenverfolgung zu vermeiden. Stellen Sie abschließend das Licht auf maximale Helligkeit ohne Pixelsättigung ein. Beginnen Sie damit, zwei Glasdeckgläser für die Ober- und Unterseite der Zelle zu nehmen.
Reinigen Sie die Deckgläser, indem Sie sie 30 Minuten lang in einem molaren Kaliumhydroxid beschallen. Spülen Sie die Deckgläser anschließend in destilliertem Wasser ab und lassen Sie sie in Wasser getaucht. Pegylieren Sie das untere Deckglas und lagern Sie es bis zur weiteren Verwendung bei minus 20 Grad Celsius.
Föhnen Sie die pegylierten Deckgläser am Tag des Experiments mit einer Stickstoffpistole. Um die einfachen Kanäle herzustellen, bereiten Sie etwa zwei Millimeter breite Streifen doppelseitiges Klebeband vor und legen Sie vier Streifen parallel zueinander im Abstand von fünf Millimetern auf das untere Deckglas. Legen Sie nun ein oberes Deckglas in die Mitte des unteren Deckglases und lassen Sie an den kurzen Kanten etwa fünf Millimeter Platz für Kanalein- und -auslässe.
Drücken Sie mit einer Pinzette vorsichtig auf die Rückseite des oberen Deckglases, um die Kanäle fest zu verschließen. Schneiden Sie den Rand einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze ab und schneiden Sie etwa 10 Millimeter aus der breiteren Öffnung heraus, damit sie mehr als 200 Mikroliter Lösung aufnehmen kann. Bereiten Sie drei Spritzennadeln vor, die in den Schlauch für die Spritzenpumpe passen.
Verbinden Sie die Nadel am Ausgang des Flusszellenkanals mit der Spritzenpumpe mit einem Polyethylenschlauch. Gleichen Sie die Kanäle mit PBS aus. Resuspendieren Sie die Raupenaggregate durch Wirbeln der Raupenlösungen.
Geben Sie dann nacheinander die erforderlichen Lösungen durch Ansaugen mit der Pumpe in den Kanal. Waschen Sie alle ungebundenen Perlen mit einer Kraft von 0,1 Pikonewton ab. Identifizieren Sie auf der Oberfläche des Flusszellenkanals die magnetischen Kügelchen, die an einzelne Moleküle des DNA-Konstrukts gebunden sind.
Suchen Sie eine Referenzperle in der Nähe. Drehen Sie die Kandidatenperle, um zu prüfen, ob sie sich frei drehen lässt. Drehen Sie die Perlen noch ein paar Umdrehungen und schätzen Sie den Rotationsradius, indem Sie eine Perle mit einem kleineren Rotationsradius wählen.
Erhöhen Sie die Kraft von null auf fünf Pikonewton, um gute einzelne angebundene Perlen zu identifizieren, indem Sie nach einer großen Änderung des Perlenbeugungsmusters suchen, die sich aus einer Dehnung des Haltebandes von fünf Kilobasen ergibt. Mit der PCR werden fünf Kilobasen aus doppelsträngigen DNA-Fragmenten hergestellt, die an einem Ende mit Biotin und am anderen Ende mit Azid markiert sind. Nachdem Sie eine Durchflusszelle mit dem PCR-Produkt vorbereitet haben, notieren Sie die X- und Y-Koordinaten der angebundenen Perle bei 1,2 Kilohertz und der Magnete in der Ruheposition.
Bewegen Sie die Magnete näher an die Durchflusszelle heran und wiederholen Sie die Messungen der Raupenposition, bis die Magnete kaum noch die Oberseite der Durchflusszelle berühren. Berechnen Sie die Kraft an jeder Magnetposition D mit einer der alternativen Methoden. Wiederholen Sie die Kraftmessungen für einige weitere DNA-Konstrukte, indem Sie drei bis fünf Beads untersuchen, um die Kraftvariabilität zwischen den magnetischen Beads zu mitteln.
Sobald sich eine richtige magnetische Perle zusammen mit einer Referenzperle befindet, klicken Sie auf die Schaltfläche "Kalibrieren", um mit der Vorbereitung für die Perlenverfolgung zu beginnen. Klicken Sie auf die Perlen im Bild, um die Positionen der Perlen zu definieren. Für die Nachführung in Z-Richtung wird die Software die Objektivlinse mit einem Piezo-Scanner in äquidistanten Schritten stufen und an jeder Position schwankungsgemittelte Perlenbilder aufzeichnen, um eine Lookup-Tabelle zu erstellen.
Aktivieren Sie Tracking und Autofokus und klicken Sie auf die Schaltfläche "Erfassen", um die Perlenpositionen aufzuzeichnen. Die Krafteinwirkung auf ein DNA-Haarnadelkonstrukt führte zu dem wurmartigen Kettenmodell der kraftinduzierten Ausdehnung. Bei sechs Piconewtons zeigte das Konstrukt Schwankungen in der Ausdehnung, die mit dem reversiblen Entzippen verbunden sind, die bei acht Piconewtons verschwanden und auf einer neuen Modellkurve einrasteten.
Haarnadel-Tracking-Experimente bei 100 Hertz zeigten eine Zunahme der Ausdehnung, aber die Histogramme lösten keine unterschiedlichen Populationen auf. Bei 1,2 Kilohertz zeigten die medianen gefilterten Trajektorien zwei unterschiedliche Populationen. Die Trennung zwischen den beiden Populationen blieb im Regime der Entpacktruppe gleich.
Der obere offene Zustand wurde allmählich mit zunehmender Kraft dominant. Die Übergangsraten variierten exponentiell, wobei die aufgebrachte Kraft das Öffnen des Reißverschlusses begünstigte und das erneute Schließen verhinderte. Im mittleren Kraftbereich wurde bei maximaler Geschwindigkeit eine Allan-Abweichung von zwei bis drei Nanometern erreicht.
Die DNA-Griffe eines SNARE-Komplexkonstrukts verhielten sich wie wurmartige Kettenpolymere. Wenn die Kraft von einem höheren Bereich gelockert wurde, kehrte die Verlängerung zur ursprünglichen Kurve zurück oder folgte einem neuen Modell. Bei 14 Pikonewtons gelang es dem SNARE-Komplex nicht, in den entpackten Zustand überzugehen, während eine erhöhte Kraft den Übergang ermöglichte.
Die vollständige Entfaltung des Komplexes bei höheren Kräften wurde durch die Refaltung an zwei Piconewton bestätigt. Die Identifizierung von richtig geformten Probenperlen-Tethern ist das Wichtigste, was Sie bei der Durchführung unseres Verfahrens beachten sollten. Dieser Schritt ermöglicht eine genaue Auswahl und damit eine Analyse der Zielstruktur.
Magnetpinzetten können außerdem verwendet werden, um die DNA-Superwicklung durch Anlegen eines Drehmoments zu untersuchen. Außerdem könnte es mit der Fluoreszenzbildgebung gekoppelt werden, um hochkomplexe Proteininteraktionen oder -entfaltung zu beobachten.
