Биомолекулы претерпевают небольшие и быстрые структурные изменения, часто в ответ на силу. Магнитный пинцет высокого разрешения может исследовать эту динамику при физиологически значимых силах. Поскольку метод выполняет наноразмерные измерения с точностью до миллисекунды, можно отслеживать тонкие изменения в нуклеиновых кислотах и белках в режиме реального времени.
Сбои в работе первого подшипника и механочувствительных белков потенциально могут привести к сердечно-сосудистым заболеваниям и нарушениям опорно-двигательного аппарата. Магнитный пинцет может дать представление о механизмах работы этих белков. Набор должен быть правильно выровнен и откалиброван для получения хорошего разрешения.
Кроме того, необходимо соблюдать осторожность при подготовке и идентификации молекулярных конструкций для измерений. Начните с установки перевернутого микроскопа на антивибрационный оптический стол. Далее установите высокоскоростную CMOS-камеру и фреймграббер.
Вертикально установите моторизованный линейный столик с длиной хода более 20 миллиметров на ручном столике XY, чтобы построить трансляционный столик для манипуляций с магнитом в 3D. Затем установите роторный шаговый двигатель и систему ремня и шкива для вращения магнита. Установите магниты на акриловый держатель, в котором одинаковые параллельные магниты расположены на расстоянии одного миллиметра друг от друга.
Отрегулируйте вертикальное положение трансляционного столика так, чтобы нижняя поверхность магнита совпадала с плоскостью образца в самом нижнем положении ступени. Используя объектив с малым увеличением, выровняйте магниты по центру поля зрения. Проверьте вращение магнита, чтобы убедиться, что смещение центра пары магнитов ограничено.
Установите суперлюминесцентный диод для подсветки шариков. Пропустите луч через магнитный зазор, убедившись, что луч правильно коллимирован, чтобы поместиться в зазор, и освещение не затеняется магнитами. Теперь установите сканер пьезообъектива на носовую часть и установите 100-кратный масляный иммерсионный объектив с числовой апертурой 1,5 для отслеживания борта.
Убедитесь, что освещение равномерно при движении магнита, чтобы избежать потенциальных артефактов при отслеживании шариков. Наконец, отрегулируйте свет на максимальную яркость без насыщенности пикселей. Начните с того, что возьмите два стеклянных покровных стекла для верхней и нижней части ячейки.
Очистите покровные стекла, обработав их ультразвуком в одном молярном гидроксиде калия в течение 30 минут. Затем промойте покровные стекла в дистиллированной воде и держите их погруженными в воду. Пегируйте нижнее покровное стекло и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия до дальнейшего использования.
В день эксперимента высушите феном пегилированные покровные стекла с помощью азотной пушки. Чтобы сделать простые каналы, подготовьте полоски двустороннего скотча шириной примерно два миллиметра и положите четыре полоски параллельно друг другу на расстоянии пяти миллиметров друг от друга на нижнее покровное стекло. Теперь поместите верхнее покровное стекло в центр нижнего покровного стекла, оставив около пяти миллиметров пространства на коротких краях для входных и выходных отверстий канала.
С помощью пинцета аккуратно нажмите на заднюю часть верхнего покровного стекла, чтобы надежно запечатать каналы. Обрежьте край наконечника пипетки объемом 200 микролитров и вырежьте примерно 10 миллиметров из более широкого отверстия, чтобы он мог вместить более 200 микролитров раствора. Подготовьте три иглы шприца, которые подходят к трубке для шприцевого насоса.
Подсоедините иглу на выходе канала проточной ячейки к шприцевому насосу с помощью полиэтиленовой трубки. Уравновесьте каналы с помощью PBS. Ресуспендирование агрегатов валика путем вихревого раствора валика.
Затем последовательно вводят необходимые растворы в канал путем отсасывания насосом. Смойте все несвязанные бусины, приложив 0,1 пиконьютона силы. На поверхности канала проточной ячейки определите магнитные шарики, привязанные к отдельным молекулам конструкции ДНК.
Найдите рядом эталонную бусину. Поверните бусину-кандидата, чтобы проверить, свободно ли она поворачивается. Поверните бусины еще на несколько оборотов и оцените радиус вращения, выбрав бусину с меньшим радиусом вращения.
Увеличьте усилие с нуля до пяти пиконьютонов, чтобы определить хорошие одиночные привязные бусины, ища большое изменение дифракционной картины валика в результате растяжения пятикилобазовой пары тросов. Используя ПЦР, подготовьте пятикилобазовую пару двухцепочечных фрагментов ДНК, меченных биотином на одном конце и азидом на другом конце. После подготовки проточной ячейки с продуктом ПЦР запишите координаты X и Y привязного шарика на частоте 1,2 килогерц и магнитов в положении покоя.
Переместите магниты ближе к проточной ячейке и повторяйте измерения положения шарика до тех пор, пока магниты едва коснутся верхней части проточной ячейки. Рассчитайте силу при каждом положении магнита D, используя любой из альтернативных методов. Повторите измерения силы еще для нескольких конструкций ДНК, исследуя от трех до пяти бусин, чтобы усреднить изменчивость силы между магнитными шариками.
После того, как подходящая магнитная бусина будет расположена вместе с эталонной бусиной, нажмите кнопку калибровки, чтобы начать подготовку к отслеживанию бусин. Нажмите на бусины на изображении, чтобы определить расположение бусин. Для отслеживания в направлении Z программное обеспечение будет шагать линзу объектива с помощью пьезосканера с равноудаленными шагами и записывать усредненные изображения флуктуаций в каждом положении для создания таблицы поиска.
Включите отслеживание и автофокусировку и нажмите кнопку приобретения, чтобы записать положение валиков. Применение силы к конструкции шпильки ДНК привело к червеобразной цепной модели силового расширения. При шести пиконьютонах конструкция отображала колебания в растяжении, связанные с обратимым расстегиванием, которые исчезали при восьми пиконьютонах и привязывались к новой кривой модели.
Эксперименты по слежению за шпильками на частоте 100 герц показали увеличение расширения, но гистограммы не разрешали отдельные популяции. При частоте 1,2 килогерца медианные отфильтрованные траектории выявили две различные популяции. Разделение между двумя группами населения оставалось неизменным в режиме расстегивания сил.
Верхнее открытое состояние постепенно становилось доминирующим с возрастающей силой. Скорость перехода варьировалась экспоненциально в зависимости от приложенной силы, способствующей расстегиванию и препятствующей повторному застежке. В промежуточном силовом режиме было получено отклонение Аллана в два-три нанометра на максимальной скорости.
Дескрипторы ДНК сложной конструкции SNARE вели себя как червеобразные цепные полимеры. Когда сила ослаблялась от более высокого режима, расширение возвращалось к исходной кривой или следовало новой модели. При 14 пиконьютонах комплекс SNARE не смог перейти в распакованное состояние, в то время как увеличенная сила позволила осуществить переход.
Полное разворачивание комплекса при более высоких силах было подтверждено повторным складыванием, наблюдаемым на двух пиконах. Идентификация правильно сформированных шариков для образцов - это самое важное, что нужно помнить при выполнении нашей процедуры. Этот шаг позволяет точно выбрать и, таким образом, проанализировать целевую структуру.
Магнитный пинцет может быть дополнительно использован для изучения супернамотки ДНК путем приложения крутящего момента. Кроме того, его можно сочетать с флуоресцентной визуализацией для наблюдения за очень сложными белковыми взаимодействиями или их развертыванием.
