生体分子は、しばしば力に応答して小さく急速な構造変化を受けます。高解像度磁気ピンセットは、生理学的に関連する力の下でこれらのダイナミクスを探索することができます。ナノスケールでミリ秒の精度で測定できるため、核酸やタンパク質の微妙な変化をリアルタイムでモニタリングすることが可能です。
最初の担持タンパク質および機械感受性タンパク質の機能不全は、心血管障害および筋骨格障害につながる可能性があります。磁気ピンセットは、これらのタンパク質の働きのメカニズムに関する洞察を提供することができます。良好な解像度を得るには、セットを適切に位置合わせおよびキャリブレーションする必要があります。
また、測定用の分子構築物の調製および同定中は注意が必要である。まず、防振光学テーブルに倒立顕微鏡を設置します。次に、高速CMOSカメラとフレームグラバーを取り付けます。
移動距離が20mmを超える電動リニアステージを手動XYステージに垂直に取り付け、3Dでの磁石操作用の並進ステージを構築します。次に、ロータリーステッピングモーターと磁石回転用のベルトとプーリーシステムを取り付けます。磁石は、同一の平行磁石が1ミリメートル間隔で配置されているアクリルホルダーに取り付けます。
磁石の底面が最下段位置のサンプル平面と揃うように、並進ステージの垂直位置を調整します。低倍率の対物レンズを使用して、磁石を視野の中心に合わせます。磁石の回転をチェックして、磁石ペアの中心の変位が制限されていることを確認します。
ビーズ照明用のスーパールミネッセントダイオードを取り付けます。ビームを磁石のギャップに通し、ビームがギャップに収まるように適切にコリメートされ、照明が磁石によって影にならないようにします。次に、ノーズピースにピエゾレンズスキャナーを取り付け、ビーズトラッキング用の1.5開口数を備えた100倍油浸対物レンズを取り付けます。
ビーズトラッキングの潜在的なアーチファクトを回避するために、照明が磁石の動きで均一であることを確認してください。最後に、ピクセルの飽和なしで光を最大の明るさに調整します。セルの上部と下部に2つのガラスカバースリップを取ることから始めます。
カバーガラスを1モル水酸化カリウムで30分間超音波処理して清掃します。次に、カバーガラスを蒸留水ですすぎ、水に浸したままにします。底のカバーガラスをペギレートし、さらに使用するまで摂氏マイナス20度で保管します。
実験当日、ペグ状のカバーガラスを窒素ガンでブロードライします。単純なチャネルを作成するには、幅約2ミリメートルの両面テープを用意し、下部カバースリップに5ミリメートル間隔で4つのストリップを平行に置きます。次に、下部カバースリップの中央に上部カバースリップを置き、チャネルの入口と出口の短いエッジに約5ミリメートルのスペースを残します。
ピンセットを使用して、トップカバースリップの背面をそっと押して、チャネルをしっかりと密閉します。200マイクロリットルのピペットチップの端を切り取り、広い開口部から約10ミリメートルを切り取り、200マイクロリットルを超える溶液を保持できるようにします。シリンジポンプのチューブに適合する3本のシリンジ針を準備します。
フローセルチャネル出口の針をポリエチレンチューブでシリンジポンプに接続します。PBSでチャネルを平衡化します。ビーズ溶液をボルテックスしてビーズ骨材を再懸濁します。
次に、ポンプで吸引することにより、必要な溶液をチャネルに順次導入します。0.1ピコントンの力を加えながら、結合されていないビーズを洗い流します。フローセルチャネル表面で、DNA構築物の単一分子につながれた磁気ビーズを特定します。
近くの参照ビードを見つけます。候補ビードを回転させて、自由に回転するかどうかを確認します。ビーズをさらに数回転させ、回転半径を推定して、回転半径の小さいビードを選択します。
力を0から5ピコニュートンに増やして、5キロベースペアのテザーストレッチに起因するビーズ回折パターンの大きな変化を探して、良好なシングルテザービーズを特定します。PCRを用いて、一方の端をビオチンで標識し、他方の端をアジ化物で標識した5キロ塩基対の二本鎖DNA断片を調製します。PCR産物でフローセルを準備した後、1.2キロヘルツでテザービーズのX座標とY座標を記録し、磁石を静止位置に記録します。
磁石をフローセルに近づけ、磁石がフローセルの上部にかろうじて接触するまでビード位置測定を繰り返します。代替方法のいずれかを使用して、各磁石位置Dでの力を計算します。さらにいくつかのDNA構築物について力の測定を繰り返し、3〜5個のビーズをプローブして、磁気ビーズ間の力の変動性を平均化します。
適切な磁気ビーズが基準ビーズと一緒に配置されたら、キャリブレーションボタンをクリックしてビードトラッキングの準備を開始します。画像内のビーズをクリックして、ビーズの位置を定義します。Z方向にトラッキングするために、ソフトウェアはピエゾスキャナーで対物レンズを等距離ステップでステップし、各位置での変動平均ビーズ画像を記録してルックアップテーブルを生成します。
トラッキングとオートフォーカスを有効にし、取得ボタンをクリックしてビードの位置を記録します。DNAヘアピン構築物への強制適用は、力誘発伸長の虫様鎖モデルをもたらした。6ピコニュートンでは、構成物は可逆的な解凍に関連する拡張の変動を示し、8ピコノートンで消え、新しいモデル曲線にスナップしました。
100ヘルツでのヘアピン追跡実験では、伸長の増加が示されましたが、ヒストグラムでは個別の集団は解決されませんでした。1.2キロヘルツで、フィルタリングされた軌道の中央値は、2つの異なる集団を明らかにしました。2つの集団間の分離は、解凍力体制において同じままでした。
上部の開放状態は、力の増加とともに徐々に支配的になりました。遷移速度は指数関数的に変化し、加えられた力は解凍に有利に働き、再圧縮を抑制した。中間力体制では、最高速度で2〜3ナノメートルのアラン偏差が得られた。
SNARE複合体のDNAハンドルは、虫のような鎖状ポリマーとして振る舞った。力がより高いレジームから緩和されると、延長は元の曲線に戻るか、新しいモデルに従いました。14ピコノートンでは、SNARE複合体は解凍状態に移行できませんでしたが、力の増加により遷移が可能になりました。
より高い力での複合体の完全な展開は、2つのピコノートンで観察された再折り畳みによって確認されました。適切に形成されたサンプルビーズテザーの識別は、手順を試みる際に覚えておくべき最も重要なことです。このステップにより、ターゲット構造の正確な選択と分析が可能になります。
磁気ピンセットはさらに、トルクを加えることによってDNAスーパーコイリングを研究するために使用することができる。また、蛍光イメージングと組み合わせて、非常に複雑なタンパク質の相互作用やアンフォールディングを観察することもできます。
