Les biomolécules subissent de petits changements structurels rapides, souvent en réponse à la force. Les pinces magnétiques à haute résolution peuvent explorer ces dynamiques sous des forces physiologiquement pertinentes. Comme la méthode effectue des mesures à l’échelle nanométrique avec une précision de la milliseconde, il est possible de surveiller les changements subtils dans les acides nucléiques et les protéines en temps réel.
Les dysfonctionnements des protéines du premier roulement et mécanosensibles peuvent potentiellement entraîner des troubles cardiovasculaires et musculo-squelettiques. Les pinces magnétiques peuvent donner un aperçu des mécanismes de fonctionnement de ces protéines. L’ensemble doit être correctement aligné et calibré pour obtenir de bonnes résolutions.
En outre, des précautions doivent être prises lors de la préparation et de l’identification des constructions moléculaires pour les mesures. Commencez par installer un microscope inversé sur une table optique antivibratoire. Ensuite, installez une caméra CMOS haute vitesse et une carte d’acquisition.
Montez verticalement une platine linéaire motorisée d’une longueur de course de plus de 20 millimètres sur une platine XY manuelle pour construire une étape de translation pour la manipulation d’aimants en 3D. Ensuite, installez un moteur pas à pas rotatif et un système de courroie et de poulie pour la rotation des aimants. Montez les aimants sur un support en acrylique dans lequel les aimants parallèles identiques sont espacés d’un millimètre.
Ajustez la position verticale de l’étage de translation de sorte que la surface inférieure de l’aimant s’aligne sur le plan d’échantillonnage à la position la plus basse. À l’aide d’un objectif à faible grossissement, alignez les aimants au centre du champ de vision. Vérifiez la rotation de l’aimant pour vous assurer que le déplacement du centre de la paire d’aimants est limité.
Installez une diode super luminescente pour l’éclairage des perles. Passez le faisceau à travers l’espace magnétique en vous assurant que le faisceau est correctement collimaté pour s’adapter à l’espace et que l’éclairage n’est pas ombragé par les aimants. Maintenant, installez un scanner d’objectif piézo sur la pièce avant et montez l’objectif d’immersion dans l’huile 100X avec une ouverture numérique de 1,5 pour le suivi du cordon.
Assurez-vous que l’éclairage est uniforme avec le mouvement de l’aimant pour éviter les artefacts potentiels dans le suivi des perles. Enfin, réglez la lumière à la luminosité maximale sans saturation des pixels. Commencez par prendre deux lamelles de verre pour le haut et le bas de la cellule.
Nettoyez les lamelles de couverture en les sonicant dans un hydroxyde de potassium molaire pendant 30 minutes. Ensuite, rincez les lamelles de couverture dans de l’eau distillée et maintenez-les immergées dans l’eau. Pegylate le couvercle inférieur et stockez-le à moins 20 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure.
Le jour de l’expérience, séchez les lamelles pégylées avec un pistolet à azote. Pour fabriquer les canaux simples, préparez des bandes de ruban adhésif double face d’environ deux millimètres de large et posez quatre bandes parallèles l’une à l’autre à cinq millimètres l’une de l’autre sur la glissière inférieure. Placez maintenant un bordereau supérieur au centre du couvercle inférieur, laissant environ cinq millimètres d’espace sur les bords courts pour les entrées et les sorties de canal.
À l’aide d’une pince à épiler, appuyez doucement sur l’arrière du couvercle supérieur pour bien sceller les canaux. Coupez le bord d’une pointe de pipette de 200 microlitres et découpez environ 10 millimètres de l’ouverture plus large pour lui permettre de contenir plus de 200 microlitres de solution. Préparez trois aiguilles de seringue qui s’adaptent au tube de la pompe à seringue.
Connectez l’aiguille sur la sortie du canal de la cellule d’écoulement à la pompe à seringue avec un tube en polyéthylène. Équilibrez les canaux avec PBS. Resuspendre les agrégats de billes en vortex les solutions de billes.
Ensuite, introduisez séquentiellement les solutions requises dans le canal en aspirant avec la pompe. Lavez toutes les perles non liées tout en appliquant 0,1 piconewtons de force. Sur la surface du canal cellulaire d’écoulement, identifiez les billes magnétiques attachées à des molécules uniques de la construction de l’ADN.
Localisez une perle de référence à proximité. Faites pivoter le cordon candidat pour vérifier s’il pivote librement. Faites pivoter les perles pendant quelques tours supplémentaires et estimez le rayon de rotation, en choisissant un cordon avec un rayon de rotation plus petit.
Augmentez la force de zéro à cinq piconewtons pour identifier les bonnes perles attachées simples en recherchant un changement important dans le diagramme de diffraction des billes résultant d’un étirement de la paire de cinq kilobases. À l’aide de la PCR, préparez cinq kilobases de fragments d’ADN double brin marqués avec de la biotine à une extrémité et de l’azoture à l’autre extrémité. Après avoir préparé une cellule d’écoulement avec le produit PCR, enregistrez les coordonnées X et Y du cordon attaché à 1,2 kilohertz et les aimants en position de repos.
Rapprochez les aimants de la cellule d’écoulement et répétez les mesures de position du cordon jusqu’à ce que les aimants touchent à peine le haut de la cellule d’écoulement. Calculez la force à chaque position D de l’aimant en utilisant l’une ou l’autre des méthodes alternatives. Répétez les mesures de force pour quelques constructions d’ADN supplémentaires sondant trois à cinq billes pour faire la moyenne de la variabilité de la force entre les billes magnétiques.
Une fois qu’une perle magnétique appropriée est localisée avec une perle de référence, cliquez sur le bouton de calibrement pour commencer à préparer le suivi des perles. Cliquez sur les perles dans l’image pour définir les emplacements des perles. Pour le suivi dans la direction Z, le logiciel fera pas à pas l’objectif l’objectif avec un scanner piézoélectrique par étapes équidistantes et enregistrera les images moyennes de perles de fluctuation à chaque position pour générer une table de correspondance.
Activez le suivi et la mise au point automatique et cliquez sur le bouton d’acquisition pour enregistrer les positions des perles. L’application de force à une construction en épingle à cheveux d’ADN a abouti au modèle de chaîne en forme de ver d’extension induite par la force. À six piconewtons, la construction présentait des fluctuations d’extension associées au dézippage réversible, qui disparaissait à huit piconewtons et s’accrochait à une nouvelle courbe de modèle.
Les expériences de suivi en épingle à cheveux à 100 hertz ont montré une augmentation de l’extension, mais les histogrammes n’ont pas résolu des populations distinctes. À 1,2 kilohertz, les trajectoires médianes filtrées ont révélé deux populations distinctes. La séparation entre les deux populations est restée la même dans le régime de la force de décompression.
L’état ouvert supérieur est devenu progressivement dominant avec une force accrue. Les taux de transition variaient exponentiellement avec une force appliquée favorisant le dézippage et inhibant la refermeture. Dans le régime de force intermédiaire, une déviation d’Allan de deux à trois nanomètres a été obtenue à la vitesse maximale.
Les poignées d’ADN d’une construction complexe SNARE se sont comportées comme des polymères de chaîne ressemblant à des vers. Lorsque la force a été relâchée à partir d’un régime plus élevé, l’extension est revenue à la courbe d’origine ou a suivi un nouveau modèle. À 14 piconewtons, le complexe SNARE n’a pas réussi à passer à l’état décompressé, alors qu’une force accrue a permis la transition.
Le déploiement complet du complexe à des forces supérieures a été confirmé par le repliement observé à deux piconewtons. L’identification des attaches de billes d’échantillon correctement formées est la chose la plus importante à retenir lors de la tentative de notre procédure. Cette étape permet une sélection précise et donc une analyse de la structure cible.
Les pincettes magnétiques peuvent également être utilisées pour étudier le super enroulement de l’ADN en appliquant un couple. En outre, il pourrait être couplé à l’imagerie par fluorescence pour observer des interactions protéiques très complexes ou en cours de déploiement.
