생체 분자는 종종 힘에 반응하여 작고 빠른 구조적 변화를 겪습니다. 고해상도 마그네틱 핀셋은 생리학적으로 관련된 힘 하에서 이러한 역학을 탐색할 수 있습니다. 이 방법은 밀리초 단위의 정밀도로 나노 스케일을 측정하기 때문에 핵산과 단백질의 미묘한 변화를 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다.
첫 번째 베어링 및 기계에 민감한 단백질의 오작동은 잠재적으로 심혈관 및 근골격계 질환을 유발할 수 있습니다. 마그네틱 핀셋은 이러한 단백질의 작동 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 좋은 해상도를 얻으려면 세트를 적절하게 정렬하고 보정해야 합니다.
또한 측정을 위한 분자 구조를 준비하고 식별하는 동안 주의를 기울여야 합니다. 진동 방지 광학 테이블에 도립 현미경을 설치하는 것으로 시작합니다. 다음으로 고속 CMOS 카메라와 프레임 그래버를 설치합니다.
이동 거리가 20mm 이상인 전동 리니어 스테이지를 수동 XY 스테이지에 수직으로 장착하여 3D로 자석 조작을 위한 변환 스테이지를 구축합니다. 다음으로 회전식 스테퍼 모터와 자석 회전용 벨트 및 풀리 시스템을 설치합니다. 동일한 평행 자석이 1mm 간격으로 배치된 아크릴 홀더에 자석을 장착합니다.
병진 스테이지의 수직 위치를 조정하여 자석의 바닥면이 가장 낮은 s와 정렬되도록 samp가장 낮은 단계 위치. 저배율 대물 렌즈를 사용하여 자석을 시야의 중심에 맞춥니다. 자석 회전을 확인하여 자석 쌍 중심의 변위가 제한되는지 확인하십시오.
비드 조명용 초발광 다이오드를 설치합니다. 빔이 틈새에 맞도록 적절하게 시준되고 조명이 자석에 의해 가려지지 않도록 자석 틈을 통해 빔을 통과시킵니다. 이제 노즈 피스에 피에조 렌즈 스캐너를 설치하고 비드 추적을 위해 100 개수 조리개가 있는 1.5X 오일 이멀젼 대물 렌즈를 장착합니다.
비드 추적에서 잠재적인 아티팩트를 방지하기 위해 조명이 자석 움직임과 균일한지 확인합니다. 마지막으로 픽셀 채도 없이 조명을 최대 밝기로 조정합니다. 셀의 상단과 하단에 두 개의 유리 커버 슬립을 가져 와서 시작하십시오.
커버슬립을 1몰 수산화칼륨에 30분 동안 초음파 처리하여 청소합니다. 그런 다음 커버슬립을 증류수로 헹구고 물에 담가 두십시오. 하단 커버슬립을 페일링하고 나중에 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.
실험 당일, 페길화된 커버슬립을 질소 건으로 불어 건조시킵니다. 간단한 채널을 만들려면 약 2mm 너비의 양면 테이프 스트립을 준비하고 하단 커버 슬립에 5mm 간격으로 4 개의 스트립을 서로 평행하게 놓습니다. 이제 하단 커버슬립의 중앙에 상단 커버슬립을 놓고 채널 입구와 출구를 위한 짧은 가장자리에 약 5mm의 공간을 남겨둡니다.
핀셋을 사용하여 상단 커버슬립의 뒷면을 부드럽게 눌러 채널을 단단히 밀봉합니다. 200마이크로리터 피펫 팁의 가장자리를 다듬고 200마이크로리터 이상의 용액을 담을 수 있도록 더 넓은 개구부에서 약 10mm를 잘라냅니다. 주사기 펌프용 튜브에 맞는 주사기 바늘 3개를 준비합니다.
플로우 셀 채널 출구의 바늘을 폴리에틸렌 튜브가 있는 주사기 펌프에 연결합니다. PBS로 채널을 평형화합니다. 비드 용액을 vortexing하여 비드 응집체를 재현탁합니다.
그런 다음 펌프로 흡입하여 필요한 용액을 채널에 순차적으로 도입합니다. 0.1피코뉴톤의 힘을 가하면서 결합되지 않은 구슬을 씻어냅니다. 유동 세포 채널 표면에서 DNA 구조의 단일 분자에 연결된 자기 비드를 식별합니다.
근처에 참조 비드를 찾습니다. 후보 비드를 회전하여 자유롭게 회전하는지 확인합니다. 구슬을 몇 바퀴 더 돌리고 회전 반경을 추정하여 회전 반경이 더 작은 구슬을 선택합니다.
힘을 0에서 5 피코네톤으로 증가시켜 5킬로베이스 쌍 테더 스트레치로 인한 비드 회절 패턴의 큰 변화를 찾아 양호한 단일 테더 비드를 식별합니다. PCR을 사용하여 한쪽 끝에는 비오틴이 표시되고 다른 쪽 끝에는 아지드가 표시된 5킬로베이스 쌍의 이중 가닥 DNA 단편을 준비합니다. PCR 산물로 플로우 셀을 준비한 후, 테더링된 비드의 X 및 Y 좌표를 1.2킬로헤르츠로 기록하고 자석을 휴지 위치에 기록합니다.
자석을 플로우 셀에 더 가깝게 이동하고 자석이 플로우 셀의 상단에 거의 닿지 않을 때까지 비드 위치 측정을 반복합니다. 다른 방법 중 하나를 사용하여 각 자석 위치 D에서의 힘을 계산합니다. 자기 구슬 사이의 힘 변동성을 평균화하기 위해 3-5 개의 구슬을 조사하는 몇 가지 DNA 구조에 대해 힘 측정을 반복합니다.
적절한 마그네틱 비드가 참조 비드와 함께 배치되면 보정 버튼을 클릭하여 비드 추적 준비를 시작합니다. 이미지에서 구슬을 클릭하여 구슬의 위치를 정의합니다. Z 방향으로 추적하기 위해 소프트웨어는 피에조 스캐너로 대물 렌즈를 등거리 단계로 밟고 각 위치에서 변동 평균 비드 이미지를 기록하여 조회 테이블을 생성합니다.
추적 및 자동 초점을 활성화하고 획득 버튼을 클릭하여 비드 위치를 기록합니다. DNA 헤어핀 구조에 대한 강제 적용은 강제 유도 확장의 웜과 같은 사슬 모델을 초래했습니다. 6 피코네톤에서 구조는 가역적 압축 풀림과 관련된 확장의 변동을 나타냈으며, 이는 8 피코뉴톤에서 사라지고 새로운 모델 곡선에 스냅되었습니다.
100Hz에서의 헤어핀 추적 실험은 확장의 증가를 보여주었지만 히스토그램은 뚜렷한 모집단을 해결하지 못했습니다. 1.2 킬로 헤르츠에서 중앙값 필터링 궤적은 두 개의 뚜렷한 집단을 나타 냈습니다. 두 인구 사이의 분리는 지퍼를 푸는 힘 체제에서도 동일하게 유지되었습니다.
상부 개방 상태는 증가된 힘으로 점차 지배적이 되었습니다. 전이 속도는 적용된 힘에 따라 기하급수적으로 다양하여 압축 해제를 선호하고 재압축을 억제했습니다. 중간 힘 영역에서, 최대 속도에서 2 내지 3 나노 미터의 앨런 편차가 얻어졌다.
SNARE 복합체 구조의 DNA 핸들은 벌레와 같은 사슬 중합체로 행동했습니다. 힘이 더 높은 영역에서 완화되었을 때, 확장은 원래 곡선으로 돌아가거나 새로운 모델을 따랐습니다. 14 피코뉴톤에서 SNARE 복합체는 지퍼가 풀린 상태로 전환되지 않은 반면 증가된 힘은 전환을 허용했습니다.
더 높은 힘에서 복합체의 완전한 전개는 두 개의 피코네톤에서 관찰된 재접힘에 의해 확인되었습니다. 적절하게 형성된 샘플 비드 테더의 식별은 절차를 시도할 때 기억해야 할 가장 중요한 사항입니다. 이 단계를 통해 정확한 선택을 할 수 있으므로 대상 구조를 분석할 수 있습니다.
마그네틱 핀셋은 토크를 적용하여 DNA 슈퍼 코일링을 연구하는 데 추가로 사용할 수 있습니다. 또한 형광 이미징과 결합하여 매우 복잡한 단백질 상호 작용 또는 풀림을 관찰할 수 있습니다.
