Le biomolecole subiscono piccoli e rapidi cambiamenti strutturali spesso in risposta alla forza. Le pinzette magnetiche ad alta risoluzione possono esplorare queste dinamiche sotto forze fisiologicamente rilevanti. Poiché il metodo effettua misurazioni su scala nanometrica con precisione al millisecondo, è possibile monitorare i sottili cambiamenti negli acidi nucleici e nelle proteine in tempo reale.
Malfunzionamenti nelle proteine di primo cuscinetto e meccanosensibili possono potenzialmente portare a disturbi cardiovascolari e muscoloscheletrici. Le pinzette magnetiche possono fornire informazioni sui meccanismi di funzionamento di queste proteine. Il set deve essere opportunamente allineato e calibrato per ottenere buone risoluzioni.
Inoltre, è necessario prestare attenzione durante la preparazione e l'identificazione dei costrutti molecolari per le misurazioni. Inizia installando un microscopio invertito su un tavolo ottico antivibrante. Quindi, installare una fotocamera CMOS ad alta velocità e un frame grabber.
Montare verticalmente uno stadio lineare motorizzato con una lunghezza di corsa superiore a 20 millimetri su uno stadio XY manuale per costruire uno stadio di traslazione per la manipolazione dei magneti in 3D. Quindi, installare un motore passo-passo rotativo e un sistema di cinghie e pulegge per la rotazione del magnete. Montare i magneti su un supporto acrilico in cui i magneti paralleli identici sono distanziati di un millimetro l'uno dall'altro.
Regolate la posizione verticale dello stadio di traslazione in modo che la superficie inferiore del magnete si allinei con il piano del campione nella posizione più bassa. Utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento, allineare i magneti al centro del campo visivo. Controllare la rotazione del magnete per assicurarsi che lo spostamento del centro della coppia di magneti sia limitato.
Installare un diodo super luminescente per l'illuminazione delle perline. Far passare il fascio attraverso lo spazio del magnete assicurandosi che il raggio sia correttamente collimato per adattarsi allo spazio e che l'illuminazione non sia ombreggiata dai magneti. Ora installa uno scanner per obiettivi piezoelettrici sul nasello e monta un obiettivo ad immersione in olio 100X con un'apertura numerica di 1,5 per il tracciamento delle perline.
Assicurarsi che l'illuminazione sia uniforme con il movimento del magnete per evitare potenziali artefatti nel tracciamento delle perline. Infine, regola la luce alla massima luminosità senza saturazione di pixel. Inizia prendendo due vetrini per la parte superiore e inferiore della cella.
Pulire i vetrini sonicandoli in un molare idrossido di potassio per 30 minuti. Quindi, sciacquare i coperchi in acqua distillata e tenerli immersi in acqua. Pegylate il coprislip inferiore e conservatelo a meno 20 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo.
Il giorno dell'esperimento, asciugare i coprivetrini pegilati con una pistola ad azoto. Per realizzare i canali semplici, preparare strisce di nastro biadesivo larghe circa due millimetri e disporre quattro strisce parallele l'una all'altra a cinque millimetri di distanza sul coperchio inferiore. Ora posiziona un coprislip superiore al centro del coprislip inferiore lasciando circa cinque millimetri di spazio sui bordi corti per le entrate e le uscite dei canali.
Utilizzando una pinzetta, premere delicatamente il retro del coperchio superiore per sigillare saldamente i canali. Tagliare il bordo di una punta di pipetta da 200 microlitri e ritagliare circa 10 millimetri dall'apertura più ampia per consentire che contenga più di 200 microlitri di soluzione. Preparare tre aghi per siringhe che si adattano al tubo per la pompa della siringa.
Collegare l'ago sull'uscita del canale della cella di flusso alla pompa della siringa con tubi in polietilene. Equilibra i canali con PBS. Risospendere gli aggregati di perline vorticando le soluzioni di perline.
Quindi introdurre sequenzialmente le soluzioni richieste nel canale aspirando con la pompa. Lavare via tutte le perle non legate applicando 0,1 piconewton di forza. Sulla superficie del canale cellulare a flusso, identificare le sfere magnetiche legate alle singole molecole del costrutto di DNA.
Individua un tallone di riferimento nelle vicinanze. Ruotare il tallone candidato per verificare se ruota liberamente. Ruota le perline per qualche altro giro e stima il raggio di rotazione, scegliendo una perlina con un raggio di rotazione più piccolo.
Aumentare la forza da zero a cinque piconewton per identificare buone perline legate singole cercando un grande cambiamento nel modello di diffrazione delle perline risultante da un allungamento del legame di cinque kilobase. Utilizzando la PCR, preparare cinque kilobasi di frammenti di DNA a doppio filamento marcati con biotina su un'estremità e azide sull'altra estremità. Dopo aver preparato una cella di flusso con il prodotto PCR, registrare le coordinate X e Y del cordone legato a 1,2 kilohertz e dei magneti in posizione di riposo.
Avvicinare i magneti alla cella di flusso e ripetere le misurazioni della posizione del tallone fino a quando i magneti toccano a malapena la parte superiore della cella di flusso. Calcolare la forza in ciascuna posizione del magnete D utilizzando uno dei metodi alternativi. Ripeti le misurazioni della forza per alcuni altri costrutti di DNA sondando da tre a cinque perle per calcolare la media della variabilità della forza tra le sfere magnetiche.
Una volta individuata una perla magnetica appropriata insieme a una perla di riferimento, fare clic sul pulsante di calibrazione per iniziare a prepararsi per il tracciamento delle perline. Fare clic sulle perline nell'immagine per definire le posizioni delle perline. Per il tracciamento nella direzione Z, il software passerà l'obiettivo con uno scanner piezoelettrico in passi equidistanti e registrerà le fluttuazioni medie delle immagini delle perline in ogni posizione per generare una tabella di ricerca.
Abilita il tracciamento e la messa a fuoco automatica e fai clic sul pulsante di acquisizione per registrare le posizioni delle perline. L'applicazione della forza a un costrutto a forcina di DNA ha portato al modello di catena simile a un verme di estensione indotta dalla forza. A sei piconewton, il costrutto mostrava fluttuazioni di estensione associate alla decompressione reversibile, che scompariva a otto piconewton e si agganciava a una nuova curva del modello.
Gli esperimenti di tracciamento a forcina a 100 hertz hanno mostrato un aumento dell'estensione, ma gli istogrammi non hanno risolto popolazioni distinte. A 1,2 kilohertz, le traiettorie filtrate mediane hanno rivelato due popolazioni distinte. La separazione tra le due popolazioni è rimasta la stessa nel regime di decompressione delle forze.
Lo stato aperto superiore divenne gradualmente dominante con l'aumento della forza. I tassi di transizione variavano esponenzialmente con la forza applicata che favoriva la decompressione e l'inibizione della ricompressione. Nel regime di forza intermedia, una deviazione di Allan di due o tre nanometri è stata ottenuta alla massima velocità.
Le maniglie del DNA di un costrutto complesso SNARE si sono comportate come polimeri a catena simili a vermi. Quando la forza è stata rilassata da un regime superiore, l'estensione è tornata alla curva originale o ha seguito un nuovo modello. A 14 piconewton, il complesso SNARE non è riuscito a passare allo stato decompresso, mentre una forza maggiore ha permesso la transizione.
Il completo dispiegamento del complesso a forze più elevate è stato confermato dal ripiegamento osservato a due piconewton. L'identificazione dei cavi del tallone del campione correttamente formati è la cosa più importante da ricordare quando si tenta la nostra procedura. Questo passaggio consente una selezione accurata e quindi un'analisi della struttura target.
Le pinzette magnetiche possono essere ulteriormente utilizzate per studiare il super avvolgimento del DNA applicando la coppia. Inoltre, potrebbe essere accoppiato con l'imaging a fluorescenza per osservare interazioni proteiche altamente complesse o lo sviluppo.
