Las infecciones virales son altamente dinámicas, y los ensayos tradicionales de punto final en virología tienen la limitación de que un punto final elegido puede conducir a información perdida. La principal ventaja de esta técnica es que con la impedancia eléctrica basada en células, es posible seguir una infección viral y la actividad de los compuestos antivirales en tiempo real. Demostrando este procedimiento estará Eef Meyen, un técnico de laboratorio de nuestro laboratorio.
Para comenzar, prepare la placa CEI tomando una placa de 96 pocillos basada en electrodos interdigitados. Agregue 100 microlitros de medio de cultivo de crecimiento a cada pozo y llene los espacios entre los pozos con DPBS. Luego, incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cuatro horas.
Para sembrar las células A549, separarlas del matraz de cultivo como se describe en el manuscrito y resuspenderlas en un medio de crecimiento fresco. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mililitros. Contar las células viables y diluirlas en un medio de crecimiento fresco para obtener la densidad celular deseada.
Después de la incubación, retire el medio de cultivo de crecimiento con una pipeta multicanal de la placa de 96 pocillos. Dispensar 100 microlitros de suspensión celular por pocillo. Una vez que las células estén equilibradas, coloque la placa en el dispositivo CEI para configurar y realizar el ensayo CEI.
Abra el software del dispositivo y, en el panel Recopilar datos, haga clic en Configuración para establecer un nuevo experimento. Conecte un ordenador portátil al dispositivo ECIS. Configure la placa comprobando las impedancias de los pozos como se indica con un color verde.
En el panel Configuración de pozo, seleccione el tipo de matriz de acuerdo con el cultureware utilizado y haga clic en Modo de tiempo de frecuencia múltiple. A continuación, inicie la medición pulsando Inicio. Mantenga el compuesto en hielo.
Haga la dilución concentrada 10 veces con un medio de ensayo equilibrado en un tubo de polipropileno de cinco mililitros y luego agregue el compuesto. En el panel Configuración de recopilación de datos, haga clic en Pausa y, después de completar el punto de tiempo actual, saque la placa de 96 pocillos. Observe la adherencia y la formación de monocapa de las células bajo un microscopio óptico.
A continuación, aspire 20 microlitros de medio de cada pocillo utilizando una pipeta multicanal, y agregue 20 microlitros de solución compuesta o vehículo en los pocillos deseados. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 15 minutos. Para preparar la solución de virus, descongele un vial de cepas de virus.
Después de hacer diluciones en el MOI deseado con medio de ensayo en un tubo de polipropileno de 15 mililitros, agregue el stock de virus. Una vez que se agrega la dilución del virus en los pocillos asignados, agregue 100 microlitros de medio de ensayo a los pocillos de control celular. Luego, descontamine los contenedores de virus empleados.
Vuelva a colocar la placa en el dispositivo CEI y haga clic en Reanudar para continuar con las mediciones durante seis días consecutivos. Para analizar los datos, haga clic en Finalizar para finalizar el experimento y agregar Introducir resumen del experimento. Una vez completada la recopilación de datos, seleccione Aceptar. Seleccione la frecuencia deseada en el panel Gráfico.
Asegúrese de que todos los pozos estén seleccionados en el panel Configuración del pozo y haga clic en Archivo, luego en Exportar datos, seguido de Datos de gráficos para exportar los datos en formato de hoja de cálculo. El ensayo CEI mostró que la cinética de la infección dependía en gran medida del tipo de célula, y las células U87 solo eran susceptibles a la infección por el virus del Zika con MOI altos. Los ensayos CEI también demostraron una monocapa celular completamente desarrollada con una alta siembra celular y no puede propagarse más a través de los electrodos CEI, lo que lleva a una ligera diferencia entre el control celular y el control del virus.
Para U87, un tipo de célula más grande, la siembra de células demasiado densamente podría haber llevado al desprendimiento completo de la monocapa celular. Una cepa representativa del virus Zika del MR766 africano en el linaje asiático PRVABC59 exhibió patrones CEI similares. Sin embargo, PRVABC59 tiene propiedades inductoras de efectos citopáticos ligeramente más lentas, también reflejadas por los valores de CIT50.
Los perfiles de impedancia de tres MOI diferentes de ambas cepas del virus del Zika demostraron que la concentración particular del compuesto retrasó la caída de la impedancia causada por la infección por el virus del Zika. El ensayo CEI reveló que la actividad antiviral dependía de los cálculos de MOI y AUCN determinaron los valores de IC50. Los valores evaluados de CIT50 demostraron potencias compuestas en la cinética del crecimiento celular y la infección.
CEI es una tecnología poderosa para evaluar y caracterizar compuestos contra la replicación del virus Zika en tiempo real, sin etiquetas y de manera no invasiva.
