Este método se puede utilizar para evaluar los efectos de la inmunidad preexistente contra el virus del dengue en la infección por el virus del Zika, utilizando el suero real del paciente humano y las células inmunes humanas primarias. El uso de muestras de suero reales para pacientes humanos y células primarias humanas proporciona una visión más profunda de la mejora dependiente de los anticuerpos del virus del Zika mediante sueros y anticuerpos preinmunes. Este método proporciona información sobre la capacidad de los anticuerpos dentro de la sangre de un paciente para mejorar una infección por virus en otras células humanas.
Es importante asegurarse de que los niveles de infección viral son lo suficientemente altos para la detección, pero lo suficientemente bajos como para no abrumar las células o interferir con la interpretación de los datos. Comience por sembrar tres veces diez a las cuartas células en 100 microlitros de medio de cultivo celular por pozo en una placa estéril y plana inferior de 96 pozos. Cuando todas las células hayan sido chapadas, coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius y 5%y haga diluciones seriales de 10 veces de muestras de suero humano descongeladas en medio libre de suero.
Asegúrese de mantener constantes las diluciones séricas y el factor de dilución para todos los sueros preinmunes antes de agregar las diluciones a las soluciones del virus y las células. A continuación, descongelar la solución de las cepas del virus del Zika en un baño de agua de 37 grados Celsius durante uno a dos minutos antes de transferir rápidamente la población al hielo. Añadir un volumen equivalente de 0,1 multiplicidad de infección del virus del Zika a las alícuotas séricas y colocar la placa en la incubadora de cultivo celular durante una hora para permitir que los anticuerpos del virus del dengue formen complejos con los viriones del zika.
Al final de la incubación, lavar las células con 100 microlitros de PBS por pozo y añadir 50 microlitros de complejo inmune a cada pocóteo. Después de las dos horas de incubación, retire el medio y lave los pozos dos veces con 100 microlitros de PBS por pozo para eliminar completamente los complejos inmunológicos y cualquier virión no conectado. A continuación, alimentar las células con 100 microlitros por pozo de medio de cultivo celular complementado con 10%suero bovino fetal.
Luego devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante 48 horas. Dos días después de la infección, lavar las células dos veces con 100 microlitros de PBS estériles por bien antes de agregar 250 microlitros de tampón de lysis celular con 10%beta mercaptoetanol a cada pozo. Pipetear hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces con arañazos para acelerar el proceso de lelisis y transferir los tonos celulares a tubos estériles etiquetados de 1,5 mililitros.
Añadir un volumen igual de 70% etanol a cada tubo y pipetear la solución de izado hacia arriba y hacia abajo de cuatro a cinco veces. Cuando las suspensiones de izado estén claras, transfiera cada solución a columnas etiquetadas a base de sílice en dos tubos de recolección de mililitros para centrifugación. Deseche el flujo que mantiene las columnas en los mismos tubos de recogida y agregue 700 microlitros de Wash Buffer 1 a cada columna para una segunda centrifugación.
Después de desechar el flujo a través, enjuague las columnas dos veces más con 500 microlitros de Wash Buffer dos por lavado. Después del segundo lavado, transfiera las columnas a nuevos tubos de recogida de dos mililitros para otra centrifugación. Agregue 30 microlitros de agua libre de RNase de 42 grados Celsius al centro de cada columna para la centrifugación y recupere el ARN eluido.
Para la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real o el análisis QRTPCR agregue un microlitro de imprimaciones específicas de genes hacia adelante y hacia atrás de 10 existencias micromolares junto con 0,25 microlitros de mezcla de transcriptasa inversa por reacción. Tenga en cuenta que los imprimadores que reconocen el material genético del virus del Zika detectarán genes virales y permitirán la cuantificación de infecciones. A continuación, agregue 12,5 microlitros de SYBR Green Mix seguidos de 25 microlitros de agua a cada reacción añadiendo 15 microlitros de Master Mix en cada pozo de placa QPCR de 96 pozos.
Cuando utilice una mezcla maestra, añada 100 nanogramos de la muestra de ARN a la mezcla y pipetee la mezcla maestra en pozos individuales de la placa QRTPCR. Tenga en cuenta que las muestras deben ejecutarse por triplicado en la misma placa QRTPCR. A continuación, ejecute las muestras en una máquina de PCR cuantitativa de acuerdo con los parámetros descritos en la tabla.
Al hacer clic en la pestaña de curva de fusión en el software del sistema para supervisar la curva de fusión. La curva de fusión mostrará un solo pico en todas las muestras para un gen en particular para confirmar la presencia de un solo amplón. Para obtener resultados óptimos, utilice incrementos de temperatura celsius de 0,5 grados entre pasos y un tiempo de retención mínimo de 10 segundos en el protocolo de curva de fusión.
A continuación, haga clic en la pestaña de datos de cuantificación para obtener un ciclo cuantitativo para cada muestra y exportar los datos a una hoja de cálculo para un análisis de cuantificación adicional. Las muestras de suero humano se pueden clasificar en tres grupos diferentes: muestras confirmadas por infección por el virus del dengue, muestras confirmadas de anticuerpos del virus del dengue y sueros sanos sin anticuerpos neutralizantes del virus del dengue o ARN. Después de 48 horas de infección, el análisis QRTPCR demuestra que la mayoría de los sueros que contienen serotipo uno a cuatro anticuerpos del virus del dengue son capaces de mejorar la replicación del virus del Zika a diferentes niveles.
El mayor aumento de los títulos del virus del Zika se encuentra en los macrófagos tratados con serotipo dos y cuatro del virus del dengue que contienen sueros en comparación con el serotipo uno y tres que muestran una inducción relativamente menor del virus del Zika. Es importante mantener un ambiente estéril, usar el equipo de protección personal adecuado y mantener siempre en hielo las muestras de suero del virus descongelado y los reactivos QPCR. Este protocolo se puede modificar fácilmente para estudiar la mejora dependiente de anticuerpos de otro flavivirus, como el virus de la fiebre amarilla, el virus del dengue o el virus del Nilo Occidental utilizando un panel de suero del paciente.
Esta técnica será muy útil para llevar a cabo futuros estudios de mejora dependientes de anticuerpos en los campos del arbovirus o la virología. Se deben utilizar en todo momento un equipo adecuado de bioseguridad, dos equipos de protección personal y todos los residuos virales deben descontaminarse en un 10% de lejía durante 30 minutos antes de su eliminación.
