Los autores están en deuda con Deborah Harris y MacKay Danielle. Apoyo a este trabajo fue proporcionado por el Departamento de Biología y la Facultad de Artes y Ciencias de la CWRU, y por el número de concesión del HHMI 52005866 para el apoyo de la educación universitaria en las ciencias biológicas.

1. Metodología de imágenes <ol><li> Derretir la glicerina gelatina en un baño de agua a 55 ° C grados durante 20-30 minutos hasta que se convierte en un líquido homogéneo. Remolino, pero no agitar el frasco para evitar la formación de burbujas. </li><li> Mientras que la gelatina se derrite, aplique una fina capa de glicerina con una Kimwipe en un portaobjetos de vidrio limpio (opcional). </li><li> Pipeta de 1 a 1,5 ml de glicerina derretido jalea con un P1000 corte punta de la pipeta en la superficie de la diapositiva para crear una primera capa fina. Pipeta con cuidado para evitar burbujas. </li><li> Deje que la gelatina solidifique durante 5 minutos sobre una superficie horizontal, a continuación, colocar la placa a -20 ° C durante 5 minutos y proceder a la alineación del embrión. Otra forma es cubrir el portaobjetos con Saran Wrap y colocarlo a 4 ° C durante un máximo de 5 días. </li><li> Pipeta una gota de embriones teñidos en 70% de glicerol / PBS u otro Antifade base de glicerol-medios de montaje (por ejemplo, o Slowfade Vectashield) en el lado de la cama de gelatina. </li><li> Comenzar antes de la alineación de los embriones por separado a la transferencia de la caída de la superficie de la gelatina. Transferencia utilizando una aguja hipodérmica inclinada, con el lado inclinado como una cuchara. </li><li> Alrededor de colocar los embriones a lo largo de 2 a 3 columnas. Si un embrión se queda atascado en la aguja, se revuelve en el desplegable que contiene los otros embriones para liberarlo. No pierdas el tiempo con cuidado la alineación en este momento. Deje algo de espacio entre las columnas. </li><li> Alinear los embriones por deslizamiento en horizontal en el medio de gelatina con la ayuda de la aguja hipodérmica. Mientras desliza, orientar las cabezas y las colas en la misma dirección. Hacerlos paralelos entre sí a lo largo de la columna. Eliminar el exceso de glicerol PBS izquierda como un camino con un pedazo de Kimiwipe trenzado. Nota: El exceso de glicerol hará que los embriones que se suelta encerrado dentro de gel, lo que resulta en la separación de las dos capas de gelatina, por lo que es difícil de cortar y montar. Por el contrario, la eliminación de glicerol demasiado se seca y se aplanan embriones. </li><li> Utilice una punta amarilla corte para esparcir una capa delgada de gel sobre los embriones (50-150 l, dependiendo de cuántos fueron alineados). </li><li> Lugar de diapositivas en congelador a -20 ° C durante 10-20 minutos o almacenar a 4 ° C durante la noche. Asegúrese de que el gel está completamente rígido antes de cortar. De lo contrario, el bloque de embriones será muy difícil de extirpar. Los mejores resultados se obtienen para el corte al día siguiente. </li><li> Bajo un microscopio de disección, utilice una hoja de afeitar para cortar completamente a través de la jalea en ambos lados de los embriones alineados. Mantenga la hoja de afeitar en un ángulo de 90 ° para realizar cortes rectos. Los cortes deben quedar muy cerca de los polos anterior y posterior de los embriones para evitar el exceso de gel que puede obstruir la imagen. </li><li> Añadir 100-200 L de PBT frío (4 ° C, PBS 0,1% Tween 20) al lado de los recortes y cuidadosamente raspe la gelatina entre los embriones con una espátula. Nota: El detergente en PBT ayuda a la eliminación de la jalea de la diapositiva sin dañar los embriones. </li><li> Usando una aguja, la transferencia del bloque de gelatina con embriones incrustado en un portaobjetos limpio para cortar más. Cortar los bloques más pequeños con embriones 5-7. Use PBT para moverse con facilidad alrededor de la manzana de gelatina. Por otra parte, colocar el bloque en una superficie de vidrio seco para dejar que se adhieren a los cristales, lo que crea más estabilidad, precisamente por el recorte de la jalea, si es necesario. </li><li> Voltear vertical los embriones incrustados en la jalea con la ayuda de una cuchilla de afeitar y una aguja. Para la visualización al microscopio, proceder con cualquiera de los dos pasos siguientes, dependiendo del tipo de microscopio están siendo utilizados. </li><li> Microscopio invertido: el lugar terminó bloques embrión en un cubreobjetos de largo, con embriones en una posición vertical. Asegúrese de que la parte del embrión con la menor cantidad de jalea estará en contacto más estrecho con el objetivo. </li><li> Microscopio vertical: hacer dos pilas con cuatro n º 1 cubreobjetos pegados con pegamento que se utiliza como &quot;apoyo&quot; y colocar el bloque de embriones de glicerol en el medio de la &quot;apoya&quot;. Puente de las pilas con un cubreobjetos de largo. </li><li> Para el análisis confocal, comprobar la distancia de trabajo de los objetivos que se utilizarán para determinar si usted puede imaginar todo el camino a través del embrión o sólo parcialmente. Por ejemplo, D. embriones melanogaster han ~ 0,55 mm de longitud y puede ser enteramente imágenes utilizando un Zeiss 20x Plan-Apo o un objetivo de 40x LD Neo-Fluor. El siguiente sitio tiene información sobre los objetivos Zeiss disponible y te ofrece la opción de buscar objetivos, de acuerdo a las distancias de trabajo: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. Resultados representante Debido a que los embriones se mantienen intactas, este método puede ser usado para tomar mediciones precisas del tamaño del embrión y las distancias entre los patrones de expresión génica. En la Figura 1, se muestra una etapa de blastodermo embriones teñidos con la tinción nuclear con DAPI (azul), anti-proteína dorsal (rojo), el ARNm sog (amarillo) y ARNm sna (verde). Proces morfológicasses, como la invaginación del mesodermo (Figura 2A, B) y la migración de las células del mesodermo (Figura 3 y 4) también se pueden visualizar con este método. Z-posiciones diferentes a lo largo del eje DV se puede obtener al cambiar el plano focal, como se muestra en las figuras 2-4. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Vertical rebanada óptica de un embrión intacto en la etapa blastodermo. Doble tinción de ARNm y proteínas. MRNAs objetivo en las sondas in situ (SOG y SNA) y la proteína manchada por el anticuerpo primario (anti-dorsal) se indican en la figura. DAPI se utiliza para etiquetar los núcleos. Tenga en cuenta que la expresión de la SOG y la SNA se encuentran en el citoplasma apical, mientras que la expresión de la dorsal es de origen nuclear. Señales fuertes de las transcripciones sog nacientes que se encuentran en los núcleos también se puede ver en este aumento. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Imagen vertical de un embrión intacto gastrulating. Sondas de ARNm utilizados y sus respectivos colores se indican en la figura. A) Tenga en cuenta que en esta etapa, tres genes manchado con la misma fluor (SCN, sog y DPP, en verde), se expresan en dominios separados espacialmente. El mesodermo invaginación expresa SNA, la capa de neuroblast expresa ind y el ectodermo expresa DPP, mientras que la expresión sog todavía está presente en las regiones ventrales del sistema nervioso. B) En un plano más profundo confocal del embrión mismo, tomamos nota de la base de la invaginación del mesodermo sna expresa con fuerza, pero su región apical expresa los niveles más bajos. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Imagen vertical de un embrión intacto con la banda de germen extendido sog ARN (amarillo);. Caracol, ind y mRNAs dpp (verde), la proteína dorsal (rojo). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). A) del plano focal cerca de la cabeza del embrión. B) Otro plano focal en la región del tronco del embrión mismo. Tenga en cuenta la masa de las células del mesodermo lateral antes de la migración (en comparación con la Figura 4), situada cerca de la línea media ventral en ambos lados de un embrión de germen de banda extendida. Neuroblastos delaminación están marcados en verde (ind y SNA). <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Imagen vertical de un embrión intacto durante la extensión de la banda de germen de sog ARN (amarillo);. Caracol, ind y mRNAs dpp (verde), la proteína dorsal (rojo). A) Nota de la neuroblastos delaminación del epitelio (flecha), teñido, tanto para ind y sna en esta etapa (verde). Tenga en cuenta también la expresión restringida de sog a la línea media ventral (amarillo). Expresión de dpp en este momento se puede ver en las caras laterales del embrión (asterisco). B) Sección óptica en el mismo embrión se muestra en A cerca del final de la longitud del embrión, que corresponde a mediados de la región posterior. Las células de la línea media ventral se tiñen para SOG.

<ol>
	<li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos.">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li><li>Gr&#946;hans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila.">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li><li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-on+imaging:+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos.">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li><li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol.">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li><li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila.">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li></ol>

La toma de imágenes de sección transversal de los embriones de Drosophila puede ser un reto, ya que requiere ya sea una disección cuidadosa de la mano rebanadas 2 o el uso de los medios de comunicación integrados para el procesamiento de microtomo, que suele ser perjudicial para tinciones fluorescentes. Por otra parte, Z-pilas hechas en un microscopio confocal se puede utilizar para hacer la reconstrucción 3D de imágenes de corte transversal. Sin embargo, es mucho tiempo para hacer varias rebanadas delgadas confocal para una reconstrucción exacta en 3D y photobleaching se convierte en problemático. Otro motivo de preocupación cuando los embriones de imágenes que están montados longitudinalmente es la dispersión de la luz que se produce al llegar a más secciones del embrión, lo que también complica la toma de medidas precisas de las señales fluorescentes con el propósito de la cuantificación de los niveles de expresión de la proteína o ARNm 1. Incluso con un microscopio confocal de dos fotones, dispersión de la luz sigue siendo una preocupación debido a la opacidad del material de la yema en el centro del embrión, lo que hace que la selección de los medios de montaje para una transparencia óptima de la muestra a ser limitada. Para evitar estos problemas, una nueva técnica llamada &quot;final de&quot; imágenes de embriones de posicionamiento vertical se ha desarrollado recientemente para la imagen en vivo y muestras fijas 4. En este trabajo, hemos desarrollado un nuevo protocolo para los embriones de montaje vertical que permite una preparación sencilla y visualización de embriones fijo o tejidos de cualquier tamaño y forma que se tiñen con múltiples sondas situ 3. Nuestro método consiste en utilizar un medio de montaje con consistencia gelatinosa que se utiliza para revestir los embriones alineados dentro de ella. Bloques de corte de este medio de montaje que contienen embriones incrustado se puede colocar en posición vertical antes de exponer en cualquier tipo de microscopio confocal. Mediante la incorporación de los embriones en la gelatina y el posicionamiento verticalmente, que son capaces de tomar horizontal secciones transversales mediante microscopía confocal, en el cual las células a lo largo del eje dorsal-ventral del embrión se presentan simultáneamente. Esta es una mejora significativa para propósitos de cuantificación ya que los problemas de dispersión de luz y photobleaching de los tintes fluorescentes que se produce en la pila convencional Z-reconstrucción de embriones montado longitudinalmente se eliminan ahora. Por lo tanto, la cuantificación de los niveles de expresión del gen o la proteína a lo largo del eje dorsal-ventral es exacta, ya que las células ubicadas en contrario dorsal-ventral posiciones son imágenes al mismo tiempo y en el mismo confocal Z-posición. Además, el método descrito nos permite obtener una completa 2-D la imagen a través del eje dorsal-ventral de un embrión de 3-D sin necesidad de utilizar complejos métodos de cálculo se desenrolla para visualizar las células en diferentes posiciones a lo largo del eje DV 6. Algunos de los pasos críticos incluyen la eliminación de exceso de glicerol después de alinear los embriones, para evitar la división entre las dos capas de gelatina. Sin embargo, si la muestra es muy deshidratada, la imagen resultante se deforme y tienen una morfología incorrecta. Además, si el medio de gelatina en todo el embrión se cortan en ángulo recto en lugar de, la imagen resultante puede parecer menos redondo y ovular más en forma, debido a una colocación incorrecta de los embriones en un ángulo de 90 grados. Por último, si la gelatina no se corta lo suficiente para que el embrión en los extremos anterior / posterior, no es posible obtener una imagen adecuada, porque la distancia de trabajo el objetivo sería utilizado principalmente para centrarse en la jalea y no del embrión. Otro paso importante que puede ser necesario cuando la imagen a finales de embriones gastrulating es separar cuidadosamente las etapas de interés en el ámbito antes de la alineación de ellos. Por lo general, los embriones se clasifican de acuerdo a las características morfológicas que puede ser más fácil de reconocer cuando está en posición longitudinal. Entre las modificaciones alternativas que se pueden hacer con este método es incluir un reactivo anti-fade (por ejemplo, p-fenilendiamina o PPD) en la segunda capa de gelatina para ayudar a proteger contra el photobleaching de los tintes fluorescentes.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycerin Jelly mounting media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences Company</td>
<td>17998-10</td>
<td>Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997.</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss LSM 700 Confocal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass microscope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-544-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72204-02</td>
<td>Size 1 &frac12; (specific for the objectives used in this work).</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass cover slips (for making supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherfinest</td>
<td>12-544-10</td>
<td>Use four coverslips glued with superglue. </td>
</tr>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td>
<td>M420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Steel back single edge industrial blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Spatula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>21-401-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hypodermic needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>1482610</td>
<td>26 Gauge</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

upright imaging of drosophila embryos

Varios conocidos gradientes morfogenéticos y los movimientos celulares se producen a lo largo del eje dorsal / ventral de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrión. Sin embargo, las técnicas actuales utilizadas para ver estos procesos son algo limitadas. El protocolo siguiente se describe una nueva técnica para el montaje fijo y etiquetado<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones para la visualización de imagen confocal con la corona. Este método consiste en la incorporación de los embriones entre dos capas de gelatina de glicerina medios de montaje e imágenes de las tiras de gelatina en posición vertical. El primer paso para intercalar los embriones es hacer una cama fina de gelatina de glicerina en una diapositiva. A continuación, los embriones son cuidadosamente alineados en esta superficie y se cubre con una segunda capa de gelatina. Después de la segunda capa se solidifica, las tiras de gelatina se cortan y se volcó en posición vertical para obtener imágenes. Las alternativas se describen para la visualización de los embriones, dependiendo del tipo de soporte del microscopio a utilizar. Puesto que todas las células a lo largo del eje dorsal-ventral se crean imágenes en un único confocal plano Z, nuestro método permite la medición precisa y la comparación de las señales fluorescentes sin photobleaching o dispersión de luz comunes a las reconstrucciones en 3D de los embriones montado longitudinalmente.

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Upright Imaging of Drosophila Embryos

Aquí se presenta un protocolo de montaje para teñido<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones en una posición vertical que permite imágenes de secciones transversales mediante microscopía confocal.

Imagen de la posición vertical Drosophila Los embriones

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Research

JoVE Journal

Biology

Upright Imaging of Drosophila Embryos

9.2K vistas.  Case Western Reserve University. Aquí se presenta un protocolo de montaje para teñido Drosophila Embriones en una posición vertical que permite imágenes de secciones transversales mediante microscopía confocal.

Video: Upright Imaging of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparación de cultivos neuronales a partir de embriones de Drosophila Midgastrula Etapa

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Investigación

Biología

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La preparación de los Drosophila Los embriones para Live-Imaging utilizando el protocolo de gota

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

La recolección y preparación de Drosophila Los embriones de registro electrofisiológico y otros procedimientos

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparación de embriones para Microscopía Electrónica de la Drosophila Tubo cardíaco embrionario

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

La disección en vivo de Drosophila Los embriones: métodos simplificados para la detección colecciones mutantes tinción con anticuerpos

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

En vivo-La centrifugación de embriones de Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Cultivos de células primarias de Drosophila Gástrula embriones

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi interferencia por inyección de dsRNA en Drosophila Los embriones

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Celular imagen Cambiar forma de vida Drosophila Los embriones

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Aislamiento y purificación de Kinesin desde Drosophila Los embriones

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...