המחברים רוצים להודות לשיתוף הפעולה בגנטיקה של תירס, פרויקט הגנומיקה של תאי תירס, דייב ג'קסון (מעבדת קולד ספרינג הארבור, ניו יורק), אן סילבסטר (מעבדה ביולוגית ימית, אוניברסיטת שיקגו, אילינוי), אנדראה גלאבוטי (אוניברסיטת ראטגרס, ניו ג'רזי) וקרולין ג. רסמוסן (אוניברסיטת קליפורניה, ריברסייד) על אספקת המניות המוטנטיות והטרנסגניות, כמו גם רוברט פ. בייקר ואלכסנדר יורקביץ' מליבת מיקרוסקופ האור המתקדם באוניברסיטת מיזורי-קולומביה על עזרתם במיקרוסקופ קונפוקלי. JMR נתמך על ידי מלגת ג'יי ויליאם פולברייט, קרן דיאן פ. ורוברט א. שארפ, והתוכנית לחקר גנום הצמח של הקרן הלאומית למדע (IOS-1546873) ל- PM. CDTC, CMRV, EDCDP ו- RJRR נתמכים על ידי תוכנית המלגות של מכללת אטנאו. CDTC, EDCDP ו- RJRR נתמכים על ידי מלגת DOST-SEI S&T לתואר ראשון. DODL נתמך על ידי Fr. Thomas Steinbugler SJ Academic Scholarship. RJRR נתמך על ידי Aiducation International-Pathways to Higher Education Scholarship. עבודה זו נתמכה על ידי בית הספר למדעים והנדסה וספריית ריזאל, אוניברסיטת אטנאו דה מנילה.

שיטות משופרות להדמיית פרימורדיה של עלי תירס

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

אנו מציגים שתי שיטות להכנת פרימורדיה של עלי תירס לדימות תאי. השיטה הראשונה (פרוטוקול סעיף 2) מאפשרת מדידה של הפרימורדיום לצורך ניתוח חתך רוחבי, ואילו השיטה השנייה (פרוטוקול סעיף 3) מאפשרת גלגול והשטחה של הפרימורדיום לצורך אנליזה של הרכבה שלמה. שיטות אלה מקלות על הדמיה תאית של FPs בפרימורדיה24 של עלי תירס (כפי שמוצג באיור 4 ובאיור 5) ומספקות פתרונות פשוטים לאתגרי הדמיה של עלי תירס מתפתחים. פרוטוקול סעיף 2 מקצר את זמן הדיסקציה ומשפר את דיוק הדגימה על ידי מדידת הפרימורדיה לפני החתך במקום להסתמך רק על פרמטרים 9,16. עם ננו טייפ זמין מסחרית, פרוטוקול סעיף 3 פותר את הבעיה ארוכת השנים של הדמיה של פרימורדיה של עלה שלם בתירס. פרוטוקול זה משפר את השיטה הקודמת, שהשתמשה בצינורות דיאליזה 31, והוא חלופה זולה בהרבה ל- CT ו- MRI11,32,33. עם זאת, כשמדובר בהדמיה של תכונות אנטומיות של עלים והפקת תוצאות אופטימליות, לשני הפרוטוקולים יש כמה מגבלות, המתוארות בטבלה 2 ונידונות ביתר פירוט להלן.
בפרוטוקול סעיף 2 נתקלנו בקושי לדמיין קווי מתאר של תאים בחתכים רוחביים עבים של פרימורדיה העלה, וצביעת נגד בצבעים פלואורסצנטיים קושרי דופן התא או פלסמה לא סיפקה תוצאות משביעות רצון. לדוגמה, FM 4-64 הפיק תוצאות תת-אופטימליות בהשוואה לסמן FP של קרום הפלזמה, p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; איור 3A-D). כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו ממליצים להשתמש בויברטום כדי לייצר קטעי רקמה דקים יותר (~0.1 מ"מ)58 אשר יאפשרו הדמיה חיה של שדה בהיר של קווי מתאר התא או אופטימיזציה של פרוטוקול הצביעה הנגדית 47,59.
בסעיף 3 של פרוטוקול, המגבלה העיקרית היא הקושי להרכיב את העלה ללא קרע, נזק או בועות אוויר, כמפורט בשלבי פרוטוקול 3.2.5-3.2.6 (איור 3E-K). מכיוון שעלה התירס סימטרי דו-צדדית, תושבת של חצי עלה ולא תושבת של עלה שלם עשויה להספיק להדמיה9. כדי לעשות זאת, פרימורדיום ניתן לחתוך עם סכין גילוח לאורך ציר האורך לאחר גלגול אותו עד אמצע הצלע, המאפשר רק מחצית העלה להיות רכוב. מגבלה נוספת של פרוטוקול סעיף 3 היא שעובי העלה יכול להגביל את הרזולוציה האופטית של אות הפלואורופור במהלך הדמיה עמוקה. כדי לטפל בבעיה זו, ניתן להשתמש בטכניקת ניקוי רקמות60. עם זאת, מצאנו כי ClearSee61, מגיב ניקוי נפוץ להדמיית רקמות צמחים, אינו תואם לפרוטוקול מכיוון שהוא גורם לדגימה ולכיסוי להתנתק מננו-קלטת. פתרון אפשרי לבעיה זו יכול להיות מריחת קרוםחדיר למחצה 31 על דגימת העלה, המאפשר לטפל בה בתמיסת הניקוי תוך החזקתה במקומה על ידי סרט הננו. שיטה כזו המאפשרת ליישם תמיסות נוזליות על העלה הלא מגולגל יכולה לשמש גם להכלאה של RNA באתרו שלם ולטכניקות אימונולוקליזציה, אשר הותאמו בעבר לפיתוח תפרחות תירס אך לא לפרימורדיה 62,63 של עלה שלם.
תיארנו פרוטוקולים לתירס, שיש לו פרימורדיה גדולה של עלים אפילו בשלב השתילה. מיני עשב אחרים עם פרימורדיה עלים קטנה בהרבה, כגון אורז, שעורה, חיטה, סטריה וברהיפודיום 16,23,64,65,66, עשויים לדרוש שימוש בכלים מדויקים נוספים כדי ליישם ביעילות פרוטוקולים אלה. יתר על כן, פרוטוקולים אלה לא נועדו לדימות תאים חיים, אשר לוכד בזמן אמת תהליכים דינמיים של היווצרות רקמות ותגובות תאיות. עם זאת, ככל שגשושיות פלואורסצנטיות, טכנולוגיות הדמיה ויכולות מחשוב ממשיכות להתקדם בדימות תאים חיים עבור צמחים67, מחקר עתידי יכול להתבסס על פרוטוקולים אלה כדי לפתח אסטרטגיות דימות תאים חיים המותאמות לתכונות הייחודיות של פרימורדיה של עלי דשא.

גידולי דשא הם מקור עיקרי של מזון ודלק ביולוגי לאוכלוסיית העולם1, ולשיפור האנטומיה של העלים יש פוטנציאל להגדיל את התפוקה שלהם 2,3. עם זאת, ההבנה הנוכחית שלנו לגבי האופן שבו אנטומיה של עלים מווסתת בעשבים מוגבלת4 ודורשת ניתוח של פרימורדיה של עלה, שכן תכונות אנטומיות ופיזיולוגיות רבות של העלה נקבעות מראש בשלב מוקדם בהתפתחות 5,6,7. טכניקות הדמיה תאית, כגון פלואורסצנטיות ודימות קונפוקלי, הן הכרחיות לחקר אנטומיה של עלי דשא ותכונות תאיות, אך קשה ליישם טכניקות אלה על פרימורדיה של עלי דשא מכיוון שהן עטופות עמוק ומגולגלות בתוך זונת העלים. טיפלנו בבעיה זו על ידי פיתוח שיטות להכנת חתכים רוחביים ותושבות עלים שלמים לא מגולגלים לניתוח פלואורסצנטי וקונפוקלי של פרימורדיה של עלי תירס, מערכת מודל לחקר אנטומיה והתפתחות של עלי דשא 2,8.
עלה התירס, כמו כל עלי העשב, מורכב מלהב דמוי רצועה עם נדן העוטף את הגבעול ומתפתח נבט 9,10,11,12,13. העלים מתפתחים מה-shoot apical meristem (SAM) בתבנית דיסטיכוסית, שבה כל עלה חדש מתחיל במיקום הפוך מהעלה הקודם, והתוצאה היא שתי שורות של עלים לאורך הציר האנכי (איור 1A)14. השלב ההתפתחותי של כל פרימורדיום עלים מזוהה על פי מיקומו ביחס ל-SAM, כאשר הפרימורדיום הקרוב ביותר מסומן כפלסטוכרון1 (P1) והפרימורדיה הבאה אחריו מסומנת כ-P2, P3 וכן הלאה (איור 1B,C)2. במהלך ההתפתחות (איור 1D), פרימורדיום העלים מופיע תחילה כתומך בצורת חצי סהר סביב בסיס ה-SAM (P1), ולאחר מכן גדל לפרימורדיום בצורת ברדס המשתרע מעל המריסטם (P2)9,10,11. השוליים הבסיסיים של מכסה המנוע מתרחבים לרוחב וחופפים זה את זה כאשר הקצה גדל כלפי מעלה, ויוצר פרימורדיום בצורת חרוט (P3-P5)10. לאחר מכן הפרימורדיום גדל במהירות באורכו, וגבול להב הנדן בבסיסו הופך בולט יותר עם היווצרות הליגולה, ההיטל דמוי השוליים בצד האדקסיאלי של העלה (P6/P7). לבסוף, העלה מתגלגל כשהוא יוצא מהזונה במהלך צמיחה במצב יציב, שבו התאים המתחלקים מוגבלים בתוך האזור הבסיסי הקטן של הלהב, ויוצרים שיפוע עם תאים מתרחבים ומתמיינים לאורך הציר הפרוקסימלי-דיסטלי (P7/P8)15. קודקוד הנבטה של שתיל תירס מכיל מספר פרימורדיה בשלבי התפתחות שונים, מה שהופך אותו למודל מצוין לחקר התפתחות עלים8.
ניתוח מדויק של התפתחות עלים מוקדמת דורש היערכות או שימוש בקריטריונים סטנדרטיים כדי להגדיר שלבים מובחנים של התפתחות ראשונית ביחס לצמיחה אחרת או פרמטרים מורפולוגיים. מכיוון שפרימורדיה של העלים מוסתרת בתוך נבט העשב, החוקרים בדרך כלל משתמשים בפרמטרים כגון גיל הצמח או גודל העלים המתעוררים כמנבאים לשלבים ולגדלים של פרימורדיה 9,16. בתירס, הגיל הכרונולוגי של הצמח נקבע על ידי מספר הימים לאחר השתילה או הנביטה (DAP/DAG)17,18. השלב הווגטטיבי (שלב V) נקבע על ידי העלה העליון עם צווארון גלוי, קו חיוור בצד האבקסי בין הלהב לנדן המתאים למיקום הליגול והאוריקלס, זוג אזורים בצורת טריז בבסיס הלהב (איור 1A,B)17,19. בין 20 ל 25 DAG, SAM הופך meristem תפרחת ומפסיק לייצר עלים חדשים20. שיעורי הצמיחה של פרימורדיה של עלי תירס יכולים להשתנות בהתאם לסביבה ולגנוטיפ של הצמח. מסיבה זו, גיל הצמח וגודל העלים המתעוררים אינם יכולים לחזות במדויק את גודל פרימורדיה העלים; עם זאת, שימוש בפרמטרים אלה יכול לעזור לחזות את טווח השלבים והגדלים של פרימורדיה למטרות ניסוי.
ניתוח חתך רוחבי הוא שיטה פופולרית לבחינת אנטומיה והתפתחות של עלים בתירס ועשבים אחרים מכיוון שהוא מאפשר דגימה של פלסטוכרונים מרובים בחתך אחד לאורך הנבטה21,22,23. שיטה זו נוחה גם להדמיה תאית של דגימות טריות, שכן העלים שמסביב משמשים כפיגום השומר על פרימורדיה העלה במקומה במהלך חתך והרכבה24. עם זאת, החיסרון של שיטה זו הוא שזה יכול להיות מאתגר לאתר במדויק את פלסטוסטרון המטרה ואת האזור בתוך הפרימורדיום בעת חתך מתוך יורה שלם. יתר על כן, מכיוון שצמיחת העלים משתנה בין פלסטוכרונים ולאורך הציר הפרוקסימלי-דיסטלי2,5, דגימה לא מדויקת עלולה לגרום לפרשנות שגויה של השלב ההתפתחותי והאזור של הפרימורדיום בקטע נתון. לכן, פיתוח שיטה לדיגום חתך רוחבי מדויק הוא קריטי להבטחת הדיוק והשחזור של ניתוחים אנטומיים והתפתחותיים של פרימורדיה של עלי דשא.
אנליזה של תושבות עלים שלמים מאפשרת חקירה מקיפה ואינטגרטיבית של תהליכים רקמתיים ותאיים המתרחשים בקנה מידה של איברים שלמים, כגון גדילה מתפשטת25 ותבנית ורידים26,27,28. השיטה מספקת סקירה פרדרמלית של העלה, ומאפשרת גילוי של תהליכים ודפוסים מובחנים שאחרת היה קשה לזהות באמצעות ניתוח חתך רוחבי24,27. שלא כמו בארבידופסיס, שם כבר קיימות שיטות מבוססות להדמיית תושבות עלים שלמים29,30, אין כיום שיטה סטנדרטית להדמיית תושבות עלים שלמים לא מגולגלים בעשבים. פרוטוקול קודם לגילוי פרימורדיה של עלי תירס מבודדים כלל חומרים נדירים ולא התאים להדמיה תאית31. טכניקות הדמיה מתקדמות, כגון טומוגרפיה ממוחשבת (CT) והדמיית תהודה מגנטית (MRI), יכולות לרכוש מידע אנטומי תלת ממדי מבלי לבודד ולפתוח את הפרימורדיה 11,32,33, אך הן יקרות ודורשות ציוד מיוחד. פיתוח טכניקה להתגבר על האילוצים שנכפו על ידי המורפולוגיה המגולגלת והחרוטית של פרימורדיה של עלים בתירס ועשבים אחרים יקדם חקירות של התכונות האנטומיות וההתפתחותיות שלהם.
כאן, אנו מציגים שיטות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית. השתמשנו בשיטות אלה כדי לכמת את מספר הוורידים ולמפות את התפלגות ההורמונים המרחבית-טמפורלית בפרימורדיה של עלי תירס עם חלבונים פלואורסצנטיים (FPs)24. השיטה הראשונה כוללת הסרת החלק העליון של עלים ישנים משתילי תירס באמצעות חשפנית תיל (איור 1E). על ידי חשיפת קצה הפרימורדיום (P5-P7), ניתן לקבוע את אורכו ללא צורך להסיר לחלוטין את העלים הישנים יותר, ובכך לאפשר חתך קל ומדויק. השיטה השנייה כוללת גלגול והרכבה של פרימורדיה שלמה (P3-P7) עם ננו-טייפ דו-צדדי שקוף (איור 1F). שיטות אלה מתאימות להדמיה של FPs24 שונים, אך זקוקות לאופטימיזציה לשימוש בצבעים פלואורסצנטיים וריאגנטים לניקוי. בנוסף, אנו מתארים כמה הליכים לשיטוח ערימות z, תפירת תמונות ומיזוג ערוצים ב- ImageJ/FIJI34, החלים על התמונות המופקות בשתי השיטות. שיטות אלה שימושיות עבור פלואורסצנטיות שגרתית או הדמיה קונפוקלית של עלי תירס, אך ניתן להתאים אותן גם למיני עשב מודל אחרים, כגון אורז, סטריה וברהיפודיום.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg"> איור 1: ארגון ומורפולוגיה של פרימורדיה של עלי תירס וסקירה כללית של השיטות . (A) ייצוג סכמטי של שתיל תירס. לתירס יש פילוטקסיה דיסטיכוסית, כאשר העלה החדש מתחיל במיקום הפוך מהעלה הקודם. מספר העלה מציין את הסדר הכרונולוגי שבו יצאו העלים מנביטה (כלומר, עלה ראשון, L1; עלה שני, L2; עלה שלישי, L3; וכו'). לכל עלה יש להב דיסטלי ונדן בזאלי התחום על ידי קולר המתאים לליגולה ולאוריקל. העלה העליון עם הצווארון הנראה לעין מציין את השלב הווגטטיבי. השתיל בדוגמה זו נמצא בשלב V2, כאשר צווארון L2 (ראש החץ) גלוי. סמל המספריים מציין את המיקום במזוקוטיל (me) שבו יש לחתוך את השתיל על מנת להיאסף. (B) ייצוג סכמטי של הירייה המנותחת המראה L1 עד L4 מבודדים, כאשר קדימות העלה L5 עד L9 מוצגות כתמונה מוגדלת ב-(C). מספר הפלסטוכרון מציין את מיקומו של הפרימורדיום ביחס ל-SAM, כאשר פרימורדיום העלה הצעיר ביותר (P1) הקרוב ביותר ל-SAM והעלה המבוגר יותר פרימורדיה (P2, P3, P4 וכן הלאה) רחוקים יותר ברצף2. (D) ייצוג סכמטי של המורפולוגיה של פרימורדיה של עלי תירס מ-P1 עד P5. (E) סקירה סכמטית של השיטה לניתוח חתך רוחבי של פרימורדיה עלה תירס. (1) גזור את העלים הישנים יותר עם חשפנית תיל. (2) למדוד את הפרימורדיום ולחתוך את היורה. (3) להרכיב את הקטע על שקופית לצורך הדמיה ועיבוד (4, 5). (F) סקירה סכמטית של השיטה לאנליזה מלאה של פרימורדיה של עלי תירס. (1) הסר את העלים שמסביב כדי לחלץ את הפרימורדיום. (2) גזור ופתח את הפרימורדיום שטוח על סרט הנאנו. (3) להרכיב את הדגימה לצורך הדמיה ועיבוד (4, 5). קיצורים: L = עלה; bl = להב; sh = נדן; co = צווארון; me = mesocotyl; V = צומח; P = פלסטוכרון; SAM = לירות meristem אפי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick</td>
			<td>EZlifego Store (Amazon)</td>
			<td>B07YB1ZXG6</td>
			<td>1 roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1692 9</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in</td>
			<td>Storz Opthalmic Instruments</td>
			<td>E0542</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>13553</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper</td>
			<td>Dowell Store (Amazon)</td>
			<td>10-22 AWG</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Carbon Steel Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-9</td>
			<td>pkg/10; for fine sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260442</td>
			<td>pkg/144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-1</td>
			<td>box/200; for general cutting/sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI17904</td>
			<td>1 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH) USA</td>
			<td>version 2.9.0/1.54s</td>
			<td>The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, &#201;cole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>box/280 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260140</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick</td>
			<td>Yecaye Store (Amazon)</td>
			<td>L354 W1.18</td>
			<td>2 rolls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260166</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260168</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempered Glass Cutting Board</td>
			<td>Hacaroa (Amazon)</td>
			<td>B09XMXBT5S</td>
			<td>4 pc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging

בתירס (Zea mays) ובעשבים אחרים (Poaceae), פרימורדיה העלים סגורה עמוק ומגולגלת בתוך זונת העלים, מה שמקשה על חקר התפתחות העלים המוקדמת. במאמר זה אנו מתארים שיטות להכנת חתכים רוחביים ופרושים שלמים של פרימורדיה של עלי תירס לצורך הדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית. השיטה הראשונה משתמשת בחשפנית תיל כדי להסיר את החלקים העליונים של עלים ישנים, לחשוף את קצה פרימורדיום העלה ולאפשר את מדידתו לדגימת חתך רוחבי מדויקת יותר. השיטה השנייה משתמשת בננו-טייפ דו-צדדי שקוף כדי לפתוח ולהרכיב פרימורדיה של עלה שלם לצורך הדמיה. אנו מראים את התועלת של שתי השיטות בהדמיה וניתוח של כתבי חלבון פלואורסצנטי בתירס. שיטות אלה מספקות פתרון לאתגרים שמציבה המורפולוגיה הייחודית של פרימורדיה של עלי תירס ויהיו שימושיות להדמיה וכימות של תכונות אנטומיות והתפתחותיות של עלים בתירס ובמיני עשב אחרים.

Grass crops are a major source of food and biofuel for the global population1, and improving leaf anatomy has the potential to increase their productivity2,3. However, our current understanding of how leaf anatomy is regulated in grasses is limited4 and requires the analysis of leaf primordia, as many anatomical and physiological traits of the leaf are predetermined early in development5,6,7. Cellular imaging techniques, such as fluorescence and confocal imaging, are indispensable for studying grass leaf anatomy and cellular traits, but these techniques are difficult to apply to grass leaf primordia because they are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl. We addressed this issue by developing methods for preparing transverse sections and unrolled whole-leaf mounts for fluorescence and confocal analysis of maize leaf primordia, a model system for studying grass leaf anatomy and development2,8.
The maize leaf, like all grass leaves, consists of a strap-like blade with a sheath that wraps around the stem and developing shoot9,10,11,12,13. The leaves develop from the shoot apical meristem (SAM) in a distichous pattern, where each new leaf initiates in the opposite position of the previous leaf, resulting in two ranks of leaves along the vertical axis&#160;(Figure 1A)14 . The developmental stage of each leaf primordium is identified by its position relative to the SAM, with the closest primordium designated as plastochron1 (P1) and the following primordia designated as P2, P3, and so on (Figure 1B,C)2. During development (Figure 1D), the leaf primordium first appears as a crescent-shaped buttress around the base of the SAM (P1), and then grows into a hood-shaped primordium that extends over the meristem (P2)9,10,11. The basal margins of the hood then expand laterally and overlap each other as the tip grows upward, forming a cone-shaped primordium (P3-P5)10. The primordium then rapidly grows in length, and the sheath-blade boundary at the base becomes more prominent with the formation of the ligule, the fringe-like projection on the adaxial side of the leaf (P6/P7). Finally, the leaf unrolls as it emerges from the whorl during steady-state growth, in which the dividing cells are restricted within the small basal region of the blade, forming a gradient with expanding and differentiating cells along the proximal-distal axis (P7/P8)15. The shoot apex of a maize seedling contains multiple primordia at different stages of development, making it an excellent model for studying leaf development8.
Accurate analysis of early leaf development requires staging or the use of standardized criteria to define distinct stages of primordium development in relation to other growth or morphological parameters. Because the leaf primordia are hidden within the grass shoot, investigators typically use parameters such as the age of the plant or the size of the emerging leaves as predictors for the stages and sizes of the leaf primordia9,16. In maize, the chronological age of the plant is determined either by the number of days after planting or germination (DAP/DAG)17,18. The vegetative stage (V stage) is determined by the uppermost leaf with a visible collar, a pale line on the abaxial side between the blade and the sheath that corresponds to the position of the ligule and auricles, a pair of wedge-shaped regions at the base of the blade&#160;(Figure 1A,B)17,19 . Between 20 and 25 DAG, the SAM transitions into an inflorescence meristem and ceases to produce new leaves20. The growth rates of maize leaf primordia can vary depending on the environment and the genotype of the plant. For this reason, plant age and the size of the emerging leaves cannot accurately predict the sizes of leaf primordia; however, using these parameters can help predict the range of primordia stages and sizes for experimental purposes.
Transverse section analysis is a popular method for examining leaf anatomy and development in maize and other grasses because it allows for the sampling of multiple plastochrons in a single section across the shoot21,22,23. This method is also convenient for cellular imaging of fresh samples, as the surrounding leaves serve as a scaffold&#160;that keeps the leaf primordia in place during sectioning and mounting24. However, a disadvantage of this method is that it can be challenging to precisely locate the target plastochron and region within the primordium when sectioning from an intact shoot. Furthermore, because leaf growth varies across plastochrons and along the proximal-distal axis2,5, imprecise sampling could result in an incorrect interpretation of the developmental stage and region of the primordium in a given section. Therefore, developing a method for precise transverse section sampling is critical for ensuring the accuracy and reproducibility of anatomical and developmental analyses of grass leaf primordia.
Whole-leaf mount analysis enables the comprehensive and integrative investigation of tissue and cellular processes that occur at the whole-organ scale, such as proliferative growth25 and vein patterning26,27,28. The method provides a paradermal overview of the leaf, allowing the discovery of distinct processes and patterns that would otherwise be difficult to detect using transverse section analysis24,27. Unlike in Arabidopsis, where there are already established methods for imaging whole-leaf mounts29,30, there is currently no standard method for imaging unrolled whole-leaf mounts in grasses. A previous protocol for unrolling isolated maize leaf primordia involved uncommon materials and was not suitable for cellular imaging31. Advanced imaging techniques, such as computed tomography (CT) and magnetic resonance imaging (MRI), can acquire 3D anatomical information without isolating and unrolling the primordia11,32,33, but they are expensive and require specialized equipment. Developing a technique to overcome the constraints imposed by the rolled and conical morphology of leaf primordia in maize and other grasses would advance investigations into their anatomical and developmental traits.
Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. We used these methods to quantify vein number and map the spatial-temporal hormone distribution in maize leaf primordia with fluorescent proteins (FPs)24. The first method involves removing the upper portion of older leaves from maize seedlings with a wire stripper (Figure 1E). By exposing the tip of the primordium (P5-P7), it becomes possible to determine its length without having to completely remove the older surrounding leaves, thus enabling easy and accurate sectioning. The second method involves unrolling and mounting whole-leaf primordia (P3-P7) with clear, double-sided nano tape (Figure 1F). These methods are suitable for visualizing various FPs24&#160;but need optimization for using fluorescent dyes and clearing reagents. In addition, we outline some procedures for flattening z-stacks, stitching images, and merging channels in ImageJ/FIJI34, which apply to the images produced by the two methods. These methods are useful for routine fluorescence or confocal imaging of maize leaves, but they can also be adapted for other model grass species, such as rice, Setaria, and Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg" /> 
Figure 1: Organization and morphology of maize leaf primordia and overview of the methods. (A) Schematic representation of a maize seedling. Maize has a distichous phyllotaxy, with the new leaf initiating at the opposite position of the previous leaf. The leaf number indicates the chronological order in which the leaves emerged from germination (i.e., first leaf, L1; second leaf, L2; third leaf, L3; etc.). Each leaf has a distal blade and a basal sheath delineated by a collar that corresponds to the ligule and auricle. The uppermost leaf with the collar visible denotes the vegetative stage. The seedling in this example is at the V2 stage, with the L2 collar (arrowhead) visible. The scissors icon indicates the location at the mesocotyl (me) where the seedling must be cut in order to be collected. (B) Schematic representation of the dissected shoot showing isolated L1 to L4, with the leaf primordia L5 to L9 shown as an enlarged image in (C). The plastochron number indicates the position of the primordium relative to the SAM, with the youngest leaf primordium (P1) closest to the SAM and the older leaf primordia (P2, P3, P4, and so on) successively farther away2. (D) Schematic representation of the morphology of maize leaf primordia from P1 to P5. (E) Schematic overview of the method for transverse section analysis of the maize leaf primordia. (1) Trim the older leaves with a wire stripper. (2) Measure the primordium and section the shoot. (3) Mount the section on a slide for imaging and processing (4, 5). (F) Schematic overview of the method for whole-mount analysis of the maize leaf primordia. (1) Remove the surrounding leaves to extract the primordium. (2) Cut and unroll the primordium flat on the nano tape. (3) Mount the sample for imaging and processing (4, 5). Abbreviations: L = leaf; bl = blade; sh = sheath; co = collar; me = mesocotyl; V = vegetative; P = plastochron; SAM = shoot apical meristem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

מחבר זרקור: שיטות משופרות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות לא מגולגלות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית  

שיטות משופרות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות לא מגולגלות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית

Grasses like maize have leaf primordia grow within the shoot, making them difficult to study. We address this problem with improved protocols for preparing maize leaf transverse sections and whole mounts for fluorescence and confocal imaging. The first protocol uses a wire stripper to cut the older leaves, allowing the measurement of the primordium prior to sectioning.The second protocol uses clear, double-sided nano tape to unroll whole leaf primordium. These protocols improve the accuracy of transverse sectioning and enable unrolling of the leaf primordia, which have been very difficult to achieve due to their rolled, conical morphology. These methods will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grasses.Based on these methods, we plan to develop live cell imaging strategies to address questions in grass leaf development.

ניתוח חתך רוחבי של פרימורדיה עלי תירס השתמשנו בסעיף 2 של פרוטוקול כדי לכמת את מספר הוורידים ולאפיין דפוסי תגובה הורמונליים במקטעים רוחביים של פרימורדיה של עלי תירס עם FPs (איור 4)24. כדי להעריך את תפקידו של ההורמון הצמחי אוקסין בצמיחת עלים ובהיווצרות ורידים, כימתנו את מספר הוורידים בפרימורדיה של מוטציה של תירס חסר אוקסין, ציצית נעלמת254. בפלסטוכרונים מוקדמים, ורידים מתפתחים מפגינים צלולריזציה ברורה בשכבת התא החציונית של פרימורדיום עלה התירס21,22. עם זאת, זיהוי וספירת ורידים באמצעות טכניקות היסטולוגיות קונבנציונליות22 יכול להיות עבודה אינטנסיבית זמן רב. לכן, כדי לכמת את הוורידים, השתמשנו בסמן חלבון התירס אוקסין אפלוקס pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (PIN1a-YFP להלן), המסמן ורידים מתפתחים וגדילים פרוקמביאליים (PCSs; איור 4A). באמצעות פרוטוקול סעיף 2 הצלחנו לתקנן את דגימת החתך הרוחבי על-ידי מדידת הפרימורדיה לפני החתך (איור 4B,C). גילינו מגמה שבה ל-vt2 יש פרימורדיום רחב יותר ויותר ורידים מהרגיל (איור 4D,E)24, אשר עולה בקנה אחד עם נתונים מעלים55 מורחבים במלואם, מה שמצביע על כך שהפגם ב-vt2 החל בשלב מוקדם של התפתחות העלים. באמצעות פרוטוקול סעיף 2 יכולנו גם לבחון באופן שיטתי את דפוסי הביטוי של כתבי FP של תגובת הורמונים בפרימורדיה של העלה (ראו דוגמאות לתמונות באיור 4F-I). באמצעות סכמת דגימה מתוקננת של חתך רוחבי, מיפינו את ההתפלגות של תגובות אוקסין, ציטוקינין (CK) וחומצה ג'יברלית (GA) על פני פלסטוכרונים ואזורים שונים של פרימורדיית עלים, וגילינו דפוסי תגובה חדשים שאנו משערים שיש להם השלכות על צמיחת עלים והיווצרות ורידים24. לכן, תוצאות מייצגות אלה מדגימות את התועלת של פרוטוקול סעיף 2 לניתוח חתך רוחבי של פרימורדיה של עלי תירס.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig04.jpg"> איור 4: תוצאות מייצגות לניתוח חתך רוחבי של פרימורדיה של עלי תירס. (A-E) כימות מספר הוורידים ורוחב הפרימורדיום בפרימורדיה של ציצית רגילה ונעלמת2 באמצעות סמן חלבון האוקסין EFFLUX PIN1a-YFP. (A) תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של חתכים רוחביים של P5 עד P7 המבטאים PIN1a-YFP בהתפתחות ורידים וגדילים פרוקמביאליים. החתכים הרוחביים צולמו במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי באמצעות מסנן FITC (עירור 495-519 ננומטר). מספר הוורידים ורוחב הפרימורדיום כומתו באמצעות כלי הקו הרב-נקודתי והקו החופשי ב-FIJI/ImageJ, בהתאמה. (B) שתיל תירס שאת העלה העליון מוציאים בעזרת חשפנית תיל כדי לחשוף את קצה העלה הרביעי (L4). הסוגר המרובע משתרע על פני אורך הפרימורדיום הצפוי, כאשר הקו המקווקו מציין את אורך האמצע. (C) דיאגרמה סכמטית של צורות פרימורדיום משתנות מ-P5 עד P7, הממחישה כיצד מספר הוורידים ורוחב הפרימורדיום באורך האמצעי (קו מקווקו אופקי) יכולים להשתנות בהתאם לשלב ההתפתחותי של הפרימורדיום. (ד,ה) מדידת רוחב פרימורדיום (D) ומספר ורידים (E) בחלק הבינוני של L4 של נורמלי ו vt2. קו המגמה מייצג ממוצעים מתגלגלים של 10 מ"מ של מדידות ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). (פ-י) תמונות קונפוקליות מייצגות של חתכים רוחביים של פרימורדיה של עלים המבטאים שילובים של PIN1a-YFP, כתב תגובת אוקסין, DR5-RFP, כתב תגובת ציטוקינין, TCS-Tomato, סמן מגיב לחומצה ג'יברלית, GAR2-YFP ו- mDII-Venus, גרסה מוטנטית של כתב קלט האיתות אוקסין DII-Venus. ערוצי FP מונחים על ערוץ השדה הבהיר בכל תמונה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר (A); 10 מ"מ (B); 100 מיקרומטר (F-I). נתון זה שונה ושוכפל באישור רוביל ומקסטין24. קיצורים: DAG = ימים לאחר הנביטה; P = פלסטוכרון; VT2 = ציצית נעלמת2; PCS = גדיל פרוקמביאלי; YFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב; FITC = isothiocyanate fluorescein; RFP = חלבון פלואורסצנטי אדום; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-Tomato = TCSv2::NLS-tdTomato; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
אנליזה מלאה של פרימורדיה של עלי תירס עקבנו אחר סעיף 3 של פרוטוקול כדי להמחיש ולנתח ביטוי FP בתושבות של עלים שלמים של פרימורדיה של עלי תירס (איור 5). על-ידי הדמיה של דפוסי ורידים עם PIN1a-YFP, מצאנו שהיווצרות ורידים מתרחשת בכל הפרימורדיום במהלך הפלסטוכרונים המוקדמים, אולם תהליך זה נעשה מוגבל באזורים הפרוקסימליים בשלב מאוחר יותר בהתפתחות (איור 5A)24. הניתוחים המשלימים את ניתוחי החתך הרוחבי, חשפו דפוסים ספציפיים לרקמות ולשלבים של תגובת הורמונים במהלך היווצרות ורידים24. דוגמה אחת היא תבנית הביטוי של כתב התגובה של CK TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomato), ביחס לביטוי PIN1a-YFP (איור 5B)24. על ידי ביצוע סעיף 3 של הפרוטוקול, הצלחנו לבצע ניתוחים איכותיים וכמותיים של ביטוי FP בפרימורדיה של העלה (איור 5D-F; נתונים שלא פורסמו). בחנו את דפוסי הביטוי של כתב תגובת אוקסין, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP), וסמן מגיב GA, pZmGAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), בתושבות עלים שלמים של מוטנטים בודדים וכפולים של vt2 וצמח ננסי3 (d3), מוטנט חסר GA56 (איור 5D). השווינו גם את הרמות היחסיות של התפשטות תאים בין פרימורדיה נורמלית לפרימורדיה של עלה vt2 באמצעות p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP42 (Cyclin-D2B-YFP), שהוא סמן למעבר G1/S במחזור התא 57 (איור 5E,F). בעוד שלא היה הבדל משמעותי בין נורמלי לבין vt2, ביטוי Cyclin-D2B-YFP היה עקבי עם פרופיל התפשטות התאים הידוע של פלסטוכרונים מוקדמים31. אנו מסיקים כי פרוטוקול סעיף 3 הוא שיטה יעילה לניתוח תושבות שלמות של פרימורדיה של עלי תירס, שקשה לדמיין אותן בשל המורפולוגיה המגולגלת שלהן.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig05.jpg"> איור 5: תוצאות מייצגות לניתוח כולל של פרימורדיה של עלי תירס. (A) תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של פרימורדיה של 7 שתילי תירס DAG המראים ורידים מתפתחים וגדילים פרוקמביאליים, כפי שמסומן על ידי סמן חלבון האוקסין EFFLUX PIN1a-YFP. פרימורדיה P3-P6 הוצאו מהבסיס, לא גולגלו ושוטחו עם הצד האדקסיאלי כלפי מעלה. כניסות מציגות צילומי תקריב של P3 ו-P4. ב-P5 וב-P6, קווים מקווקווים תוחמים את הקצה הדיסטלי של אזורי השגשוג, שבהם רוב הגדילים הפרוצמביאליים עדיין מתפתחים ומתרחבים. (ב,ג) תמונות קונפוקליות מייצגות המציגות את הביטוי של PIN1a-YFP וכתב תגובת ציטוקינין, TCS-Tomato, באזור השוליים הפרוקסימלי של פרימורדיום P5. (D) תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של P4 primordia המראות את הביטוי של כתב תגובת אוקסין, DR5-RFP, וסמן מגיב לחומצה ג'יברלית, GAR2-YFP במוטציות רגילות ובודדות וכפולות של ציצית נעלמת2 וצמח ננסי3. (E) תמונות קונפוקליות מייצגות של P3 ו/או P4 המראות את הביטוי של Cyclin-D2B-YFP, כתב למעבר G1/S במחזור התא. (F) כמויות יחסיות של התפשטות תאים בפרימורדיה של עלה P3/P4 של נורמלי ו-vt2, מכומתות על ידי מדידת הצפיפות המשולבת של אות Cyclin-D2B-YFP על פני שטח הפרימורדיום באמצעות ImageJ/FIJI. העמודות מייצגות את ממוצע המידות ± שגיאת התקן של הממוצע. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר (A,D,E); 200 מיקרומטר (B); 100 מיקרומטר (C). איור 4A-C שונה ושוכפל באישור Robil ו-McSteen24, ואילו איור 4D-F הוא נתונים שלא פורסמו על ידי המחברים. קיצורים: DAG = ימים לאחר הנביטה; P = פלסטוכרון; VT2 = ציצית נעלמת2; D3 = צמח ננסי3; YFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב; RFP = חלבון פלואורסצנטי אדום; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-Tomato = TCSv2::NLS-tdTomato; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; Cyclin-D2B-YFP = pZmCyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP; ns = אין הבדל משמעותי; au = יחידה שרירותית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
קובץ משלים 1: דוגמאות להתפתחות עלים בשתילי תירס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239_S_File_1_Leaf_staging_maize_seedling_Fall2019%20(1).xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים S1: דגימות צמחים וחומרים המשמשים בפרוטוקולים. (א,ב) שתיל תירס 7-8 DAG עם זונת העלה העליון הוסר באמצעות חשפנית תיל. (B) השיבוץ מראה תקריב של הצילום עם הפרימורדיום P6 החשוף. (ג-ג) נבטים של שתילי תירס כאשר הזונות העליונות הוסרו לצורך ניתוח חתך רוחבי (C,D) והעלים שמסביב הוסרו במלואם לצורך ניתוח הרכבה שלמה (E-G). (H) גליל ננו-טייפ דו-צדדי שקוף מג'ל פוליאוריתן. (ט,י) פרימורדיום עלה P6 (I) ואזור פרוקסימלי של עלה P8 (J) נפרש והורכב על שקופיות זכוכית עם סרט ננו. (K) מגלשת זכוכית עם פרימורדיום עלים לא מגולגל המותקן על במה של מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. קיצור: DAG = ימים לאחר הנביטה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/S_FIGURE_1.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging at JoVE.com

פרימורדיה של עלי תירס עטופה ומגולגלת עמוק, מה שמקשה על מחקרם. כאן, אנו מציגים שיטות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית.

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

לעשבים כמו תירס יש פרימורדיה של עלים לגדול בתוך הנבט, מה שהופך אותם לקשים למחקר. אנו מטפלים בבעיה זו באמצעות פרוטוקולים משופרים להכנת חתכים רוחביים של עלי תירס ותושבות שלמות להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית. הפרוטוקול הראשון משתמש בחשפנית תיל כדי לחתוך את העלים הישנים, ומאפשר מדידה של הפרימורדיום לפני החיתוך.הפרוטוקול השני משתמש בננו-טייפ דו-צדדי ברור כדי לפתוח את פרימורדיום העלה השלם. פרוטוקולים אלה משפרים את הדיוק של חתך רוחבי ומאפשרים גלגול של פרימורדיה עלה, אשר היה קשה מאוד להשיג בשל המורפולוגיה המגולגלת והחרוטית שלהם. שיטות אלה יהיו שימושיות להדמיה וכימות של תכונות אנטומיות והתפתחותיות של עלים בתירס ובעשבים אחרים.בהתבסס על שיטות אלה, אנו מתכננים לפתח אסטרטגיות הדמיה של תאים חיים כדי לענות על שאלות בהתפתחות עלי דשא.

improved-methods-for-preparing-transverse-sections-unrolled-whole

Research

JoVE Journal

Biology

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging

1.9K Views.  Ateneo de Manila University. לעשבים כמו תירס יש פרימורדיה של עלים לגדול בתוך הנבט, מה שהופך אותם לקשים למחקר. אנו מטפלים בבעיה זו באמצעות פרוטוקולים משופרים להכנת חתכים רוחביים של עלי תירס ותושבות שלמות להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית. הפרוטוקול הראשון משתמש בחשפנית תיל כדי לחתוך את העלים הישנים, ומאפ...

Video: מחבר זרקור: שיטות משופרות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות לא מגולגלות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית  

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study early leaf development. Here, we describe methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. The first method uses a wire stripper to remove the upper portions of older leaves, exposing the tip of the leaf primordium and allowing its measurement for more accurate transverse section sampling. The second method uses clear, double-sided nano tape to unroll and mount whole-leaf primordia for imaging. We show the utility of the two methods in visualizing and analyzing fluorescent protein reporters in maize. These methods provide a solution to the challenges presented by the distinctive morphology of maize leaf primordia and will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grass species.

Maize leaf primordia are deeply ensheathed and rolled, making them difficult to study. Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging.

﻿Imaging Transverse Sections of Maize Leaf Primordia

Imaging Transverse Sections of Maize Leaf Primordia  

Begin by cutting the desired aged maize seedling at the mesocotyl tissue using a small knife or pair of scissors. Clean the seedling with a paintbrush. Then hold the wire stripper with its jaws facing the chute.Position the chute to the selected hole and squeeze the stripper handles together. Slide the stripper away from the chute to trim the upper portion of the leaves. Use a ruler to measure the length from the primordium's tip to the chute's base.To begin the leaf primordium imaging, hold the chute steady on a smooth surface under a stereo microscope at around 0.8x magnification. Using a razor blade or scalpel, make an initial cut slightly above the target region to discard the distal portion of the chute. Then obtain around 0.25 to 0.8 millimeter thin sections at the desired points along the length of the primordium.Once done, mount the leaf section on a clean glass slide. Apply a few drops of water directly to the section using a pipette. And place a cover slip on top.Apply a few more drops through the edges of the cover slip if needed. Place the slide on the epifluorescence microscope's stage and adjust the settings to visualize the fluorophore. Using this method, chance resection sampling was standardized by measuring the primordia prior to sectioning.A trend was discovered showing that the vanishing tassel two had a wider primordia and more veins than normal, indicating that the defect in the mutant began early in the leaf development. This method also enabled the systematic examination of the expression patterns of hormone response fluorescent protein reporters in the leaf primordia.

הדמיה של חתכים רוחביים של פרימורדיה של עלי תירס

Imaging Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia

Begin the preparation of the glass slide by cutting a rectangular piece of clear, double-sided nano tape and sticking it to the center of a clean glass slide without removing the protective plastic film on the top side of the tape. Next, dissect the chute by removing the upper portion of the older leaves with a wire stripper. Then hold the chute by the mesocaudal and carefully remove the surrounding leaves with a dental probe to extract the primordia of interest.For mounting the primordium, remove the protective film from the tape. Lay the exposed primordium on the tape. Cut the primordium at the base using a razor blade, discarding the basal stem and the hypocaudal.For smoother unrolling, lubricate the inner, or, adaxial leaf surface by dipping the needle tip into 100%glycerol. Unroll the primordium using a dental probe with a bent needle. Position the needle tip parallel to the surface and unfurl the outer basal margin by gently pressing it against the tape.With the outer margin adhering to the tape, align the needle tip parallel to the long axis of the leaf. Gently slide the needle sideways to unroll and flatten the leaf onto the tape. Apply a drop of water to the unrolled primordium.Immediately place a cover slip on the water drop and the primordium. Gently press down the edges of the cover slip so that they adhere to the tape. Once done, place the slide on the epifluorescence microscope stage to visualize the fluorophore.This method was followed to visualize and analyze the fluorescent protein expression in maize leaf primordia. Complementary to the transverse section analysis. The whole leaf mount analysis revealed tissue and stage-specific patterns of formal response during vein formation.Whole mount analysis method enabled qualitative and quantitative analyses of fluorescent protein expression in the maize leaf primordia, indicating the effectiveness of this method in examining the maize leaf primordia which are difficult to image due to their rolled morphology.