Los autores agradecen a diversos usuarios de Twitter que plantearon preguntas sobre el protocolo presentado en el documento que describe la tecnología VNp. La figura 1A se generó utilizando iconos de flaticon.com. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Kent y financiado por el Consejo de Investigación de Biotecnología y Ciencias Biológicas (BB/T008/768/1 y BB/S005544/1).

El trabajo bacteriano realizado sigue las regulaciones locales, nacionales e internacionales de contención de bioseguridad acordes con el nivel de peligro de bioseguridad particular de cada cepa.
1. Selección de diferentes VNps
<ol><li>Identifique las secuencias VNp. NOTA: Para el presente estudio, se han identificado tres secuencias de VNp1 que resultan en rendimiento máximo y exportación vesicular de las proteínas examinadas hasta la fecha: VNp2, VNp6 y VNp15. Actualmente no está claro por qué ciertas variantes de VNp funcionan de manera más eficiente con algunas proteínas que con otras; por lo tanto, se recomienda que se generen fusiones entre una nueva proteína de interés con cada variante de VNp (es decir, VNp2, 6 o 15). VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEA AGKTKEGVL VNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEA AEKTKEGVM VNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVE Los plásmidos que permiten la expresión de la proteína de interés con diferentes fusiones amino terminales VNp se han puesto a disposición comercialmente (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Diseñar una estrategia de clonación para insertar el gen de interés en el extremo 3' del ADNc que codifica para el VNp en una de estas construcciones, o adaptar un plásmido existente integrando el ADNc VNp sintetizado aguas arriba del primer codón ATG del gen que codifica para la proteína de interés. Utilice los métodos descritos en1.</li>
	<li>Para proteínas tóxicas, utilice un vector con un promotor de expresión represible o un promotor con un mínimo de ruido de expresión no inducido.</li>
	<li>Clone la etiqueta de secuencia VNp en el amino-terminal de la proteína de fusión. Asegúrese de que las etiquetas de afinidad, las secuencias de escisión de la proteasa, etc., y la proteína de interés se encuentran en el lado carboxilo de la etiqueta VNp. Se recomienda separar el VNp del péptido aguas abajo con una región enlazadora flexible, como dos o tres repeticiones de una secuencia de polipéptidos -G-G-S-G- (Figura 1). NOTA: Use plásmidos con una selección de antibióticos que no se dirija al peptidoglicano, lo que debilita la superficie celular y reduce el rendimiento de vesículas. Kanamicina y cloranfenicol (ver Tabla de Materiales) fueron los antibióticos preferidos utilizados para este estudio.</li>
</ol>2. Cultivo celular bacteriano e inducción de proteínas
NOTA: Las cepas bacterianas típicamente utilizadas en este protocolo son Escherichia coli BL21 (DE3) o W3110. Las células de E. coli se cultivan en caldo de lisogenia (LB) (10 g/L triptona; 10 g/L NaCl; 5 g/L de extracto de levadura) o caldo excelente (TB) (12 g/L triptona; 24 g/L de extracto de levadura; 4 mL/L 10% de glicerol; 17 mM KH 2 PO 4; 72 mM K2HPO4, sales esterilizadas en autoclave por separado) (ver Tabla de materiales). En la Figura 2 se muestran imágenes de ejemplo que muestran cada paso de la inducción de proteínas y el posterior proceso de aislamiento y purificación.
<ol><li>Cultivar 5 ml de LB a partir de transformaciones bacterianas frescas a 37 °C hasta la saturación y utilizarlos para inocular 25 ml de TB en un matraz cónico de 500 ml, todos con la selección adecuada de antibióticos.</li>
	<li>La relación superficie:volumen es un factor importante para optimizar este sistema. Utilice un matraz de volumen lo más grande posible (p. ej., matraz de 5 L que contenga 1 L de cultivo; para series de optimización, utilice 25 ml de medio en un matraz de 500 ml).</li>
	<li>Incubar los cultivos de matraces de agitación más grandes en una incubadora a 37 °C con agitación a 200 rpm (≥25 mm de tiro orbital) hasta alcanzar un valor de densidad óptica de 600 nm (OD600) de 0,8-1,0. NOTA: La vesiculación es óptima cuando las células se cultivan a 37 °C. Sin embargo, algunas proteínas recombinantes requieren expresión en temperaturas más bajas. Si este es el caso de la proteína de interés, se debe utilizar la etiqueta VNp6, ya que esto permite la exportación de vesículas de alto rendimiento a temperaturas de hasta 25 °C.</li>
	<li>Para inducir la expresión de proteínas recombinantes del promotor T7, agregue isopropil β-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG) a una concentración final de hasta 20 μg/ml (84 μM) (ver Tabla de materiales). La inducción de la expresión de proteínas recombinantes debe ocurrir en la fase logarítmica tardía (es decir, OD600 típico de 0.8-1.0) para la producción de vesículas. NOTA: La duración del período de inducción puede diferir entre las proteínas, algunas alcanzando la producción máxima a las 4 h y otras durante la noche (18 h). Hasta la fecha, se ha obtenido la máxima exportación de vesículas en cultivos nocturnos.</li>
</ol>3. Aislamiento de vesículas recombinantes
<ol><li>Granular las células por centrifugación a 3.000 x g (4 °C) durante 20 min.</li>
	<li>Para esterilizar los medios que contienen vesículas para el almacenamiento a largo plazo, pase los medios de cultivo despejados a través de un filtro de polietersulfona (PES) de 0,45 μm estéril y sin detergente (consulte la Tabla de materiales). NOTA: Para probar la exclusión de células viables del filtrado que contiene vesículas, coloque en placa agar LB e incube durante la noche a 37 °C.</li>
	<li>Para concentrar las vesículas en un volumen más pequeño, pase los medios estériles que contienen vesículas a través de un filtro estéril y sin detergente de ésteres de celulosa mixta (MCE) de 0,1 μm (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Lave suavemente la membrana con 0.5-1 ml de PBS estéril usando un raspador celular o esparcidor de plástico para eliminar cuidadosamente las vesículas de la membrana. Transfiera a un tubo de microfuga nuevo. NOTA: Las vesículas purificadas pueden almacenarse en medios estériles o solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 °C. Existen ejemplos de proteínas recombinantes almacenadas en estas vesículas durante 6 meses, de esta manera, sin pérdida de actividad enzimática.</li>
</ol>4. Liberación de proteínas solubles de vesículas aisladas
<ol><li>Una vez que las vesículas que contienen proteínas se han aislado en el medio estéril/tampón, someta las membranas lipídicas vesiculares a sonicación utilizando un programa apropiado para el aparato (por ejemplo, ciclos de encendido y apagado de 6x 20 s) y centrifugar a 39,000 x g (4 ° C) durante 20 minutos para eliminar los restos de vesículas. NOTA: El choque osmótico o el tratamiento con detergente se pueden usar como una alternativa para abrir las vesículas, pero se debe considerar el impacto sobre la funcionalidad de las proteínas y / o la aplicación posterior.</li>
	<li>Si la fusión de VNp permanece citosólica y no se libera en el medio, aísle la proteína utilizando protocolos estándar (p. ej., resuspender los gránulos celulares en 5 ml de un tampón de extracción apropiado (20 mM tris, 500 mM NaCl), sonicar y eliminar los restos celulares por centrifugación).</li>
</ol>5. Determinación de la concentración de proteínas
<ol><li>Determinar la concentración de proteínas mediante densitometría en gel de análisis de muestras triplicadas1. Ejecute junto con los estándares de carga de albúmina sérica bovina (BSA) en geles de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio teñido con coomassie (SDS-PAGE). Escanee y analice los geles utilizando el software apropiado (por ejemplo, Imagen J; consulte la Tabla de materiales).</li>
</ol>6. Visualización de la formación de vesículas y vesículas aisladas por microscopía de fluorescencia
NOTA: Si las células contienen marcadores de membrana o fusión VNp marcados con fluorescencia, se pueden usar imágenes de células vivas para seguir la formación de vesículas. Alternativamente, se pueden usar colorantes lipídicos fluorescentes para visualizar vesículas para confirmar la producción y purificación.
<ol><li>Montaje celular<ol><li>Inducir la expresión de fusión de VNp durante varias horas antes de montarlo en el cubreobjetos.</li>
		<li>Método de almohadilla de agarosa (Figura 3A-C): pipetear las células en una almohadilla delgada (<1 mm), circular LB-agarosa (2%) que se ha dejado formar y colocar en un portaobjetos de vidrio limpio. Permita que las células se asienten y se equilibren y coloque un cubreobjetos de 50 mm x 25 mm sobre la almohadilla y las celdas. Sostenga el cubreobjetos en su lugar con espaciadores y cinta adhesiva.</li>
		<li>Método de polietileneimina (PEI) (Figura 3D-F): esparce 20 μL de PEI al 0,05% (endH2O) sobre un cubreobjetos con punta de pipeta y deja actuar durante 3-5 min para que se una al vidrio sin dejar secar. Agregue 50 μL de cultivo celular y déjelo durante 5-10 minutos para asegurarse de que las bacterias se hayan asociado con la superficie recubierta de PEI4. Lave el cubreobjetos con 100 μL de medio antes de colocarlo en el portaobjetos y manténgalo en su lugar con espaciadores y cinta adhesiva.</li>
	</ol></li>
	<li>Montaje de vesículas<ol><li>Pipeta vesículas purificadas en una almohadilla delgada (<1 mm), circular LB-agarosa (2%) que se ha dejado formar y fijar en un portaobjetos de vidrio limpio. Una vez que el líquido se haya secado, coloque un cubreobjetos de 50 mm x 25 mm sobre la almohadilla y las vesículas. Sostenga el cubreobjetos en su lugar con espaciadores y cinta adhesiva.</li>
		<li>El colorante lipídico fluorescente FM4-64 es capaz de teñir las membranas5, y por lo tanto se puede utilizar para visualizar vesículas. Agregue FM4-64 (ver Tabla de materiales) a vesículas purificadas a una concentración final de 2 μM (de un stock de 2 mM disuelto en dimetilsulfóxido [DMSO]) e imagen después de una incubación de 10 minutos. Esto es especialmente útil para identificar vesículas que contienen cargas no marcadas con fluorescencia5.</li>
		<li>Enjuague los cubreobjetos con el mismo medio utilizado para cultivar las células observadas. NOTA: Algunos medios complejos (por ejemplo, TB) pueden exhibir autofluorescencia, lo que puede resultar en un exceso de señal de fondo.</li>
	</ol></li>
	<li>Imágenes vesículas NOTA: En la Figura 4 se pueden ver ejemplos de imágenes microscópicas de vesículas recombinantes VNp.<ol><li>Monte el portaobjetos en un microscopio invertido (consulte la Tabla de materiales) utilizando un objetivo de inmersión en aceite y déjelo durante 2-3 minutos para permitir que la muestra se asiente y la temperatura se equilibre. NOTA: Todas las imágenes de células vivas para cada muestra deben completarse dentro de los 30 minutos posteriores al montaje de las células en cubreobjetos para minimizar el impacto de la fototoxicidad y el estrés anaeróbico. Por esta razón, las imágenes de un solo plano son preferibles a las pilas z.</li>
		<li>Utilice fuentes de luz apropiadas (p. ej., diodo emisor de luz [LED] o bombilla halógena; consulte la Tabla de materiales) y combinaciones de filtros para la(s) proteína(s)/colorante(s) fluorescente(s) que se utiliza6.</li>
		<li>Use una lente de alto aumento (es decir, 100x o 150x) y alta apertura numérica (es decir, NA ≥1.4) para obtener imágenes de las células microbianas y las vesículas.</li>
		<li>Determinar la intensidad mínima de luz requerida para visualizar las señales de fluorescencia de las células y/o vesículas. Esto puede requerir algún ajuste de la exposición y la configuración de ganancia para la cámara en uso. NOTA: Los tiempos de exposición típicos de las cámaras CMOS (semiconductores complementarios de óxido metálico) actuales varían entre 50 y 200 ms, dependiendo del sistema de imágenes.</li>
		<li>Para imágenes de un solo fotograma, utilice un promedio de tres imágenes para reducir el ruido de fondo aleatorio dependiente del hardware.</li>
		<li>Para imágenes de lapso de tiempo, espere de 3 a 5 minutos entre fotogramas individuales. NOTA: Dependiendo de la configuración del microscopio, es posible que sea necesario ajustar intermitentemente el enfoque durante experimentos de lapso de tiempo más largos.</li>
	</ol></li>
</ol>

Producción e imagen de vesículas recombinantes llenas de proteínas a partir de E. coli

<ol>
	<li>Eastwood, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+vesicle-packaged+recombinant+protein+production+from+E.+coli.">High-yield vesicle-packaged recombinant protein production from E. coli.</a> Cell Reports Methods. 3 (2), 100396 (2023).</li><li>Makino, T., Skretas, G., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+engineering+for+improved+expression+of+recombinant+proteins+in+bacteria.">Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria.</a> Microbial Cell Factories. 10, 32 (2011).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+recombinant+protein+secretion+efficiency+in+gram-positive+bacteria:+Signal+peptide+and+beyond.">Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: Signal peptide and beyond.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 139 (2019).</li><li>Lewis, K., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+nature:+rational+design+of+sterile-surface+materials.">Surpassing nature: rational design of sterile-surface materials.</a> Trends in Biotechnology. 23 (7), 343-348 (2005).</li><li>Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+exocytosis+and+endocytosis.">Imaging exocytosis and endocytosis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 365-371 (1996).</li><li>Mulvihill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+in+fission+yeast.">Live cell imaging in fission yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (10), (2017).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum.">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).</li><li>Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+mCherry+variants+with+long+Stokes+shift,+red-shifted+fluorescence,+and+low+cytotoxicity.">Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity.</a> PloS One. 12 (2), e0171257 (2017).</li><li>Periz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+dynamic+F-actin+network+regulates+transport+and+recycling+of+micronemes+in+Toxoplasma+gondii+vacuoles.">A highly dynamic F-actin network regulates transport and recycling of micronemes in Toxoplasma gondii vacuoles.</a> Nature Communications. 10 (1), 4183 (2019).</li><li>Qiu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+patchy+and+hollow+rectangular+platelet+micelles+from+crystallizable+polymer+blends.">Uniform patchy and hollow rectangular platelet micelles from crystallizable polymer blends.</a> Science. 352 (6286), 697-701 (2016).</li></ol>

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos u otros conflictos de intereses.

El método marcado con péptidos amino-terminales para la producción de proteínas recombinantes descrito anteriormente es un proceso simple, que produce consistentemente grandes cantidades de proteína que pueden aislarse y / o almacenarse de manera eficiente durante meses.
Es importante destacar los pasos clave en el protocolo que se requieren para un uso óptimo de este sistema. En primer lugar, la etiqueta VNp1 debe ubicarse en el extremo N, seguida de la proteína de interés y cualquier etiqueta apropiada. También es importante evitar el uso de antibióticos que se dirigen a la capa de peptidoglicano, como la ampicilina.
En términos de condiciones de crecimiento, se necesitan medios ricos (por ejemplo, medios LB o TB) y una alta relación superficie: volumen para maximizar la producción de vesículas. La temperatura óptima para la producción de vesículas extracelulares es de 37 °C, pero también deben considerarse las condiciones típicamente requeridas para la expresión de la proteína de interés. Para temperaturas de inducción más bajas, se debe usar VNp6. Fundamentalmente, la inducción del promotor T7 debe lograrse utilizando no más de 20 μg / ml (84 μM) IPTG una vez que las células alcanzan un OD600 de 0.8-1.0. Las proteínas expresadas utilizando el sistema alcanzan la producción máxima de vesículas a las 4 h o después de la inducción nocturna.
A pesar de la simplicidad de este protocolo, requiere optimización. La fusión de variantes de VNp, las temperaturas de expresión y los períodos de inducción pueden diferir según la proteína de interés. Además, existe la necesidad de optimizar la purificación y posterior concentración de vesículas extracelulares de los medios. El procedimiento actual no es escalable y puede llevar mucho tiempo. Estas son las limitaciones de esta metodología.
La tecnología VNp tiene muchas ventajas sobre los métodos tradicionales2. Permite la exportación vesicular de diversas proteínas, siendo el tamaño máximo expresado con éxito hasta la fecha de 175 kDa para las vesículas que permanecen internas y 85 kDa para las que se exportan. Además, esta tecnología puede aumentar significativamente el rendimiento de proteínas recombinantes con una gama de propiedades físicas y actividades. Las vesículas exportadas que contienen la proteína de interés pueden aislarse mediante filtración simple de los medios preaclarados y, posteriormente, pueden almacenarse, en medios de cultivo estériles o tampón, a 4 °C durante varios meses.
Las aplicaciones de este sistema son diversas, desde la ciencia del descubrimiento hasta la biotecnología aplicada y la medicina (por ejemplo, a través de la producción de terapias funcionales)3. La facilidad de producción, el procesamiento posterior y el alto rendimiento son cualidades atractivas en estas áreas y especialmente en la industria.

La bacteria gramnegativa E. coli es un sistema atractivo para la producción de proteínas recombinantes tanto a escala industrial como académica. No solo es rentable y fácil de cultivar en lotes a altas densidades, sino que se ha establecido un amplio espectro de reactivos, cepas, herramientas y promotores para promover la generación de proteínas funcionales en E. coli1. Además, las técnicas de biología sintética están superando obstáculos típicamente relacionados con la aplicación de modificaciones postraduccionales y el plegamiento de proteínas complejas2. La capacidad de dirigir la secreción de proteínas recombinantes en medios de cultivo es atractiva para mejorar el rendimiento y reducir los costos de fabricación. El envasado controlado de proteínas definidas por el usuario en vesículas de membrana ayuda al desarrollo de productos y tecnologías dentro de las industrias biotecnológica y médica aplicada. Hasta ahora, ha habido una falta de métodos ampliamente aplicables para secretar proteínas recombinantes de E. coli 3.
Eastwood et al. han desarrollado recientemente un método basado en el marcado de péptidos para producir y aislar vesículas recombinantes que contienen proteínas de E. coli1. Este péptido nucleador de vesículas (VNp) permite la producción de vesículas de membrana bacteriana extracelular, en las que se puede dirigir la proteína recombinante de elección para simplificar la purificación y el almacenamiento de la proteína diana, y permite rendimientos significativamente más altos que los normalmente permitidos por los cultivos de matraces agitados. Se han reportado rendimientos de cerca de 3 g de proteína recombinante por litro de cultivo de matraz, con rendimientos >100 veces más altos que los obtenidos con proteínas equivalentes que carecen de la etiqueta VNp. Estas vesículas recombinantes enriquecidas con proteínas pueden purificarse y concentrarse rápidamente a partir de los medios de cultivo y proporcionar un entorno estable para el almacenamiento. Esta tecnología representa un gran avance en la producción de proteínas recombinantes de E. coli. Las vesículas compartimentan proteínas tóxicas y que contienen enlaces disulfuro en una forma soluble y funcional, y apoyan la purificación simple, eficiente y rápida de proteínas funcionales empaquetadas en vesículas para almacenamiento a largo plazo o procesamiento directo1.
Las principales ventajas que presenta esta tecnología sobre las técnicas actuales son: (1) la aplicabilidad a una gama de tamaños (1 kDa a >100 kDa) y tipos de proteínas; (2) facilitar la formación de enlaces disulfuro inter e intraproteicos; (3) aplicable a complejos multiproteicos; (4) se puede utilizar con una gama de promotores y cepas estándar de E. coli de laboratorio; (5) la generación de rendimientos de proteínas a partir de matraces de agitación que normalmente sólo se observan con cultivos de fermentación; las proteínas se exportan y empaquetan en vesículas unidas a la membrana que (6) proporcionan un ambiente estable para el almacenamiento de la proteína soluble activa; y (7) simplifica el procesamiento posterior y la purificación de proteínas. Es probable que esta herramienta de proteína recombinante simple y rentable tenga un impacto positivo en las industrias biotecnológica y médica, así como en la ciencia del descubrimiento.
Aquí, un protocolo detallado, desarrollado durante varios años, describe las condiciones óptimas para producir vesículas recombinantes llenas de proteínas a partir de bacterias con la tecnología VNp. Se muestran imágenes de ejemplo de este sistema en la práctica, con una proteína fluorescente que se expresa, lo que permite visualizar la presencia de vesículas durante las diferentes etapas de la producción, purificación y concentración. Finalmente, se proporciona orientación sobre cómo usar imágenes de células vivas para validar la producción de vesículas que contienen fusión VNp a partir de las bacterias.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Melford</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Acros Organics (Thermofisher Scientific)</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli DH10&#946;</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for microscope</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Molecular Probes (Invitrogen)</td>
			<td>T-3166</td>
			<td>Dissolved in DMSO, stock concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Open Source</td>
			<td></td>
			<td>Downloaded from: https://imagej.net/ij/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Gibco (Thermofisher Scientific)</td>
			<td>11815-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source for micrscope</td>
			<td>Cairn Research Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB) / LB agar</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10 g/L Tryptone; 10 g/L NaCl; 5 g/L Yeast Extract (1.5 g/L agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph imaging software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane filter (0.1 &#181;m, MCE)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VCWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Express PLUS membrane filter (0.45 &#181;m, PES)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HPWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids allowing expression of protein of interest with different VNp amino terminal fusions&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth (TB)</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td>12 g/L Tryptone; 24 g/L Yeast Extract; 4 ml/L 10% glycerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized production and analysis of recombinant protein-filled vesicles from e. coli

Este sistema innovador, que utiliza una etiqueta peptídica corta, que exporta múltiples proteínas recombinantes en vesículas unidas a la membrana de E. coli, proporciona una solución efectiva a una serie de problemas asociados con la expresión de proteínas recombinantes bacterianas. Estas vesículas recombinantes compartimentan las proteínas dentro de un microambiente que facilita la producción de proteínas de bacterias, tóxicas, insolubles o que contienen enlaces disulfuro de bacterias. El rendimiento de proteínas aumenta considerablemente en comparación con la expresión bacteriana típica en ausencia de la etiqueta peptídica nucleante de vesículas. La liberación de proteínas empaquetadas en vesículas apoya el aislamiento del medio de cultivo y permite el almacenamiento activo de proteínas a largo plazo. Esta tecnología da lugar a un mayor rendimiento de proteínas funcionales empaquetadas en vesículas para un procesamiento posterior simplificado para una amplia gama de aplicaciones, desde biotecnología aplicada hasta ciencia de descubrimiento y medicina. En el presente artículo y el video asociado, se proporciona un protocolo detallado del método, que destaca los pasos clave en la metodología para maximizar la producción de vesículas llenas de proteínas recombinantes.

The Gram-negative bacteria E. coli is an attractive system for recombinant protein production on both industrial and academic scale. It is not only cost-effective and straightforward to culture in batches to high densities, but a broad-spectrum of reagents, strains, tools, and promoters have been established to promote the generation of functional proteins in E. coli1. Additionally, synthetic biology techniques are now overcoming obstacles typically related to the application of post-translational modifications and folding of complex proteins2. The ability to target the secretion of recombinant proteins into culture media is attractive for improving yield and reducing manufacturing costs. Controlled packaging of user-defined proteins into membrane vesicles assists the development of products and technologies within the applied biotechnology and medical industries. Until now, there has been a lack of widely applicable methods for secreting recombinant proteins from E. coli 3.
Eastwood et al.&#160;have recently developed a peptide tagging-based method for producing and isolating recombinant protein-containing vesicles from E. coli1. This Vesicle Nucleating peptide (VNp) allows the production of extracellular bacterial membrane vesicles, into which the recombinant protein of choice can be targeted to simplify purification and storage of the target protein, and allows significantly higher yields than normally allowed from shaking flask cultures. Yields of close to 3 g of recombinant protein per liter of flask culture have been reported, with &#62;100x higher yields than those obtained with equivalent proteins lacking the VNp tag. These recombinant protein-enriched vesicles can be rapidly purified and concentrated from the culture media and provide a stable environment for storage. This technology represents a major breakthrough in E. coli recombinant protein production. The vesicles compartmentalize toxic and disulfide-bond containing proteins in a soluble and functional form, and support the simple, efficient, and rapid purification of vesicle-packaged, functional proteins for long-term storage or direct processing1.
The major advantages this technology presents over current techniques are: (1) the applicability to a range of sizes (1 kDa to &#62;100 kDa) and types of protein; (2) facilitating inter- and intra- protein disulfide-bond formation; (3) applicable&#160;to multiprotein complexes; (4) can be used with a range of promoters and standard lab E. coli strains; (5) the generation of yields of proteins from shaking flasks normally only seen with fermentation cultures; proteins are exported and packaged into membrane bound vesicles that (6) provide a stable environment for storage of the active soluble protein; and (7) simplifies downstream processing and protein purification. This simple and cost-effective recombinant protein tool is likely to have a positive impact on the biotechnology and medical industries, as well as discovery science.
Here, a detailed protocol, developed over several years, describes the optimal conditions to produce recombinant protein-filled vesicles from bacteria with the VNp technology. Example images of this system in practice are shown, with a fluorescent protein being expressed, allowing the presence of vesicles during different stages of the production, purification, and concentration to be visualized. Finally, guidance is provided on how to use live cell imaging to validate the production of VNp fusion-containing vesicles from the bacteria.

Autor destacado: La producción de proteínas recombinantes 

Producción y análisis optimizados de vesículas recombinantes llenas de proteínas de E. coli

We are trying to understand the dynamic interactions between molecules within living cells. For biochemical analysis, it can be necessary to use large quantities of recombinant protein. These can be extremely difficult to express in a correctly-folded and functional form.If a protein was found to be misfolded or insoluble when expressed in bacteria, researchers would either have to resort to mammalian cells, which is expensive and relatively slow, or use synthetic polypeptides. Our protocol allows for high yield expression as well as export of challenging proteins from E.coli. Adding a short cleavable peptide sequence to the amino terminus of the protein not only enhances the production and yield of every protein we have tested to date, but also exports the protein from the cell into the media.Along with simplifying protein expression, it also simplifies downstream protein purification.

BL21 DE3 E. coli que contiene la construcción de expresión VNp6-mNeongreen se cultivó hasta la fase logarítmica tardía (Figura 2A). La expresión de VNp6-mNeongreen fue inducida por la adición de IPTG al cultivo (concentración final de 20 μg/mL o 84 μM), que posteriormente se dejó crecer durante la noche a 37 °C con agitación vigorosa (200 rpm, ≥25 mm de tiro orbital). A la mañana siguiente, el cultivo mostró fluorescencia mNeongreen7 (Figura 2B), que permaneció visible en los medios después de la eliminación de células bacterianas por centrifugación (Figura 2C). La presencia de VNp-mNeongreen dentro del cultivo y los medios de cultivo despejados fue confirmada por SDS-PAGE (Figura 2D). Las vesículas que contienen mNeongreen se aislaron en un filtro MCE de 0,1 μm (Figura 2E) y se resuspendieron en PBS (Figura 2F). Las vesículas purificadas se montaron posteriormente en una almohadilla de agarosa (Figura 3A-C) y se obtuvieron imágenes utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio (Figura 4A). La presencia de membranas vesiculares se confirmó utilizando el colorante fluorescente lipofílico FM4-64 (Figura 4B). Las células de E. coli que expresan la proteína de la membrana interna CydB fusionada con mNeongreen (verde) y VNp6-mCherry2 (magenta)8 muestran producción de vesículas e inserción de carga en células bacterianas vivas (Figura 4C). Las figuras 4A, B se capturaron utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio, mientras que la figura 4C se adquirió utilizando microscopía de iluminación estructurada (SIM), utilizando los métodos descritos anteriormente 9,10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig01.jpg"> Figura 1: Resumen de la tecnología VNp desde el diseño de una estrategia de clonación hasta la purificación y almacenamiento de vesículas extracelulares. (A) Esquema de una proteína de fusión VNp típica. VNp en el extremo NH2, seguido de un enlazador flexible y una combinación apropiada de etiquetas de afinidad y fluorescencia (Tag1, Tag 2, sitio de escisión de la proteasa [por ejemplo, TEV]) y proteína de interés. (B) Diagrama esquemático que resume el protocolo para la expresión y purificación de vesículas de membrana rellenas de proteínas recombinantes de E. coli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig02.jpg"> Figura 2: Etapas de producción y purificación de vesículas VNp6-mNg. Los cultivos de células de E. coli que contienen la expresión VNp-mNeongreen se construyen en luz azul antes de (A) o después de (B) expresión inducida por IPTG de la proteína de fusión. Las células de (B) se eliminaron por centrifugación, dejando vesículas llenas de VNp-mNeongreen en el medio (C). (D) Se analizaron muestras equivalentes de A, B y C mediante SDS-PAGE y tinción de coomasie. Las vesículas se aislaron en un filtro de 0,1 μm (E) y posteriormente se lavaron en un volumen apropiado de tampón (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig03.jpg"> Figura 3: Procedimiento de montaje celular para obtener imágenes de vesículas y producción de vesículas. (A-C) El método de almohadilla de agarosa y (D-F) el método PEI para montar células de E. coli en el cubreobjetos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig04.jpg"> Figura 4: Imágenes microscópicas de vesículas recombinantes VNp. Imágenes de emisión verde (A) y roja (B) de diferentes campos de vesículas que contienen FM4-64 etiquetadas con VNp6-mNeongreen montadas en una almohadilla de agarosa. (C) La obtención de imágenes de células de E. coli que expresan la proteína de la membrana interna CydB fusionada con mNeongreen (verde) y VNp6-mCherry2 (magenta) muestra la producción de vesículas y la inserción de carga en células bacterianas vivas. (A, B) se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio, mientras que (C) se adquirió utilizando microscopía de iluminación estructurada (SIM). Barras de escala: (A,B) = 10 μm; (C) = 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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El presente protocolo describe un método detallado para la producción bacteriana de proteínas recombinantes, incluidas proteínas típicamente insolubles o que contienen enlaces disulfuro, empaquetadas dentro de vesículas extracelulares unidas a la membrana. Esto tiene el potencial de aplicarse a áreas versátiles de la investigación científica, incluida la biotecnología aplicada y la medicina.

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an ...

Estamos tratando de entender las interacciones dinámicas entre las moléculas dentro de las células vivas. Para el análisis bioquímico, puede ser necesario utilizar grandes cantidades de proteína recombinante. Estos pueden ser extremadamente difíciles de expresar en una forma correctamente plegada y funcional.Si se descubriera que una proteína está mal plegada o es insoluble cuando se expresa en bacterias, los investigadores tendrían que recurrir a células de mamíferos, que es costosa y relativamente lenta, o usar polipéptidos sintéticos. Nuestro protocolo permite la expresión de alto rendimiento, así como la exportación de proteínas desafiantes de E. coli. Agregar una secuencia corta de péptidos escindibles al extremo amino de la proteína no solo mejora la producción y el rendimiento de cada proteína que hemos probado hasta la fecha, sino que también exporta la proteína de la célula a los medios.Además de simplificar la expresión de proteínas, también simplifica la purificación de proteínas aguas abajo.

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Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

4.9K vistas.  University of Kent. Estamos tratando de entender las interacciones dinámicas entre las moléculas dentro de las células vivas. Para el análisis bioquímico, puede ser necesario utilizar grandes cantidades de proteína recombinante. Estos pueden ser extremadamente difíciles de expresar en una forma correctamente plegada y funcional.Si se descubriera que una proteína está mal plegada o es insoluble cuando se expresa en bacterias, los investigadores tendrían que recurrir a células de mamíferos, que ...

Video: Autor destacado: La producción de proteínas recombinantes 

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an effective solution to a range of problems associated with bacterial recombinant protein expression. These recombinant vesicles compartmentalise proteins within a micro-environment that facilitates the production of otherwise challenging, toxic, insoluble, or disulfide-bond containing proteins from bacteria. Protein yield is increased considerably when compared to typical bacterial expression in the absence of the vesicle-nucleating peptide tag. The release of vesicle-packaged proteins supports isolation from the culture medium&#160;and permits long-term active protein storage. This technology gives rise to increased yields of vesicle-packaged, functional proteins for simplified downstream processing for a diverse range of applications from applied biotechnology to discovery science and medicine. In the present article and the associated video, a detailed protocol of the method is provided, which highlights key steps in the methodology to maximize recombinant protein-filled vesicle production.

The present protocol describes a detailed method for the bacterial production of recombinant proteins, including typically insoluble or disulfide-bond containing proteins, packaged inside extracellular membrane-bound vesicles. This has the potential to be applied to versatile areas of scientific research, including applied biotechnology and medicine.

Investigación

Biología

Recombinant Vescicle Isolation from Bacterial Culture to Release Soluble Protein

After cloning the vesicle nucleating peptide, or VNP sequence tag, at the amino terminal of the fusion protein, culture a five-milliliter lysogeny broth, or LB starters, from fresh bacterial transformations at 37 degrees Celsius to saturation. Then, use that to inoculate 25 milliliters of terrific broth, or TB, containing appropriate antibiotic selection in a 500-milliliter conical flask. Incubate the flask in an incubator at 37 degrees Celsius while shaking at 200 rotations per minute or greater than equal to a 25-millimeter orbital throw until the culture reaches a 600-nanometer optical density value, or OD 600, of 0.8 to 1.0.Then, induce recombinant protein expression from the T7 promoter by adding IPTG to a final concentration of up to 20 micrograms per milliliter or 84 micromolar. After allowing sufficient time for induction, pellet the cells by centrifugation at 3000 G at 4 degrees Celsius for 20 minutes. Pass the supernatant through a sterile and detergent free 0.45 micron PES filter to sterilize the vesicle containing media for long-term storage.To concentrate the vesicles into a smaller volume, pass the sterile vesicle containing media through a sterile and detergent free 0.1 micron MCE filter. Then, gently wash the membrane with 0.5 to 1 milliliters of sterile phosphate-buffered saline, or PBS, and use a cell scraper or plastic spreader to carefully remove vesicles from the membrane. Transfer the vesicle concentrate to a fresh micro centrifuge tube using a pipette.Purified vesicles can be stored at four degrees Celsius. Sonicate the protein containing vesicles in the sterile media using an appropriate schedule to disrupt the vesicular lipid membranes and release protein. Centrifuge the sonicated suspension at 39, 000 G and 4 degrees Celsius for 20 minutes to remove the vesicular debris.BL21DE3 Escherichia coli containing the VNp6-mNeongreen expression construct displayed mNeongreen fluorescence being induced overnight with IPTG. The fluorescence remained visible in the culture after the removal of bacterial cells by centrifugation. The presence of VNp-mNeongreen within the culture in cleared culture media was confirmed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis.The resuspended purified vesicles in PBS also displayed fluorescence.

Aislamiento de vesículas recombinantes de cultivo bacteriano para liberar proteína soluble

Visualizing Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli by Fluorescence Microscopy

Visualizing Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli by Fluorescence Microscopy  

To stain the vesicle membrane, add the fluorescent lipid dye FM4-64 to the purified vesicles at a final concentration of two micromolar and incubate for 10 minutes before imaging. After isolating the protein filled vesicles from Escherichia coli culture, pipette the purified vesicles onto a less than one millimeter thin circular 2%LB agarose pad that has been allowed to form and set on a clean glass slide. Once the liquid has dried, place a 50 millimeter by 25 millimeter cover slip over the vesicles on the pad.Hold the cover slip in place with spacers and adhesive tape. Then mount the slide onto an inverted microscope using an oil immersion objective, and leave the sample for two to three minutes to settle and the temperature to equilibrate. For single frame images, use three image averaging to reduce hardware dependent random background noise.For time-lapse imaging, allow three to five minutes between individual frames. Widefield fluorescence microscopy imaging showed the purified amnion green containing vesicles. The lipophilic fluorescent dye, FM4-64, confirmed the presence of vesicle membranes.Structured illumination microscopy of the live bacterial cells expressing the inner membrane protein, CydB, fused to amnion green, and VNp6-mCherry2 showed vesicle production and cargo insertion.