Esta investigación fue apoyada por el Programa Principal de Investigación (E0210702-03) del Instituto de Investigación Alimentaria de Corea (KFRI), financiado por el Ministerio de Ciencia y TIC.

1. Preparación del inóculo bacteriano
<ol><li>Retire el vial de caldo de glicerol almacenado a -80 °C.</li>
	<li>Retire la cepa bacteriana (2-10 μL) del vial con una punta de pipeta estéril. NOTA: En este protocolo se utilizan cepas de Acinetobacter, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) y A. ursingii (24-1). </li>
	<li>Inocular una placa de agar sangre disponible comercialmente (agar de soja tríptico suplementado con un 5% de sangre de oveja, ver Tabla de Materiales) con la bacteria. NOTA: También se pueden utilizar otros medios, como agar nutriente o agar MacConkey.</li>
	<li>Raye la superficie del agar usando un asa estéril con flameado intermitente para diluirla.</li>
	<li>Coloque la placa de agar boca abajo en una incubadora e incube a 30 °C durante la noche durante 20-24 h.</li>
	<li>Escoja una sola colonia del cultivo bacteriano con una aguja estéril e inocule 5 ml de caldo estéril de infusión cerebro-corazón (BHI, ver Tabla de materiales) con el cultivo.</li>
	<li>Incubar el caldo inoculado en una incubadora agitadora a 30 °C durante la noche durante 20-24 h a unas 150 rpm.</li>
	<li>Transfiera 1 ml del cultivo nocturno a un tubo de microcentrífuga estéril y centrifugue el cultivo nocturno a 6.000 × g durante 10 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Retire el sobrenadante con una pipeta.</li>
	<li>Con un vórtice, vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).</li>
	<li>Centrifugar a 6.000 × g durante 10 min a RT y retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Vuelva a suspender el gránulo en BHI estéril diez veces diluido utilizando vórtice hasta una densidad óptica de alrededor de 0,1 a 600 nm. NOTA: La densidad óptica de alrededor de 0,1 equivale aproximadamente a 107 UFC/ml.</li>
</ol>2. Cuantificación de biopelículas mediante cristal violeta
<ol><li>Agregue 200 μL de inóculo a cada pocillo de una placa estéril de poliestireno de 96 pocillos (ver Tabla de Materiales) y agregue 200 μL de agua desionizada a cada uno de los pocillos más externos para evitar que los pocillos internos se sequen15.</li>
	<li>Agregue 200 μL de BHI diluido diez veces a cada pocillo de la misma placa como control negativo.</li>
	<li>Incubar la placa a 25 °C durante 24 h.</li>
	<li>Retire el sobrenadante con una pipeta. NOTA: La pipeta multicanal suele ser más conveniente para varias muestras.</li>
	<li>Agregue con cuidado 300 μL de PBS a cada pocillo y retire el sobrenadante con una pipeta. NOTA: La pipeta multicanal suele ser más conveniente para varias muestras.</li>
	<li>Repita el paso 2.5 dos veces más.</li>
	<li>Añadir 200 μL de solución de violeta cristalina (1%) (ver Tabla de Materiales) a cada pocillo e incubar a RT durante 30 min.</li>
	<li>Repita los pasos 2.4-2.6.</li>
	<li>Agregue 200 μL de etanol absoluto a cada pocillo e incube durante 15 minutos a RT. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.</li>
	<li>Transfiera 100 μL de elución de cada pocillo a una nueva placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Mida la absorbancia a 595 nm con un lector de microplacas (consulte la tabla de materiales).</li>
	<li>Cuando la absorbancia sea superior a 2,0, se debe diluir adecuadamente la muestra hasta alcanzar una absorbancia inferior a 2,0 en etanol absoluto y se debe medir como se indica en el paso 2.11. A continuación, calcule la absorbancia de la muestra (valor final) multiplicando el valor observado por el factor de dilución.</li>
	<li>Calcule la absorbancia real de las muestras restando el valor promedio del control negativo del valor de cada pocillo de las muestras de prueba en la misma placa de pocillo.</li>
</ol>3. Recuento de viabilidad de la biopelícula
<ol><li>Agregue 1 mL de inóculo (paso 1) a cada pocillo de una placa estéril de poliestireno de 12 pocillos15. Incubar la placa a 25 °C durante 24 h. Retire el sobrenadante con una pipeta.</li>
	<li>Agregue con cuidado 1,5 ml de PBS estéril a cada pocillo y retire el sobrenadante con una pipeta. Agregue 1 ml de PBS estéril a cada pocillo.</li>
	<li>Raspe el fondo y las superficies de la pared del pozo con raspadores de celdas instalados.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular recolectada a un tubo de plástico estéril (10-1) que contenga 9 ml de solución salina (0,85% de NaCl) y 10-20 perlas de vidrio (consulte la tabla de materiales). NOTA: Para recoger cualquier residuo de biopelícula que quede en la superficie inferior del pozo, se puede resuspender y transferir con una pipeta utilizando solución salina del tubo 10-1 .</li>
	<li>Agite el tubo 10-1 durante 60 s a una velocidad máxima.</li>
	<li>Realice una dilución seriada de 10 veces transfiriendo 1 mL al siguiente tubo estéril (10-2) que contenga 9 mL de solución salina (0,85 % NaCl) hasta 10-7.</li>
	<li>Esparcir 100 μL de cada dilución en agar Acinetobacter (ver Tabla de Materiales) e incubar las placas de agar a 30 °C durante 24-42 h.</li>
	<li>Cuente manualmente el número de colonias rojas típicas en cada plato en el rango entre 10 y 250.</li>
	<li>Calcule el número de células viables en la biopelícula de cada pocillo utilizando la siguiente ecuación: Células viables = Número de colonias × Factores de dilución × 10</li>
</ol>4. Visualización de biopelículas mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM)
<ol><li>Añadir 200 μL de inóculo a cada pocillo de una placa estéril de 96 pocillos destinada al análisis microscópico.</li>
	<li>Incubar la placa a 25 °C durante 24 h.</li>
	<li>Retire el sobrenadante con una pipeta.</li>
	<li>Agregue con cuidado 300 μL de agua desionizada esterilizada con filtro a cada pocillo y retire el sobrenadante con una pipeta.</li>
	<li>Repita el paso 4.4.</li>
	<li>Preparar la mezcla de SYTO 9 y yoduro de propidio (ver Tabla de Materiales) diluida en agua desionizada esterilizada por filtro hasta una concentración final de 10 μM y 60 μM, respectivamente.</li>
	<li>Agregue la mezcla a cada pocillo a 200 μL e incube la placa durante 20-30 min a RT en la oscuridad.</li>
	<li>Repita los pasos 4.3-4.4</li>
	<li>Visualice las biopelículas adheridas a la superficie inferior utilizando CLSM con la longitud de onda de excitación de 488 nm y 561 nm y el rango de longitud de onda de emisión de 499-535 nm y 568-712 nm, respectivamente.</li>
</ol>

Evaluación de la formación de biopelículas de Acinetobacter y caracterización de biopelículas

<ol>
	<li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+pathophysiological+overview+of+Acinetobacter+infections:+a+century+of+challenges.">Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges.</a> Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).</li><li>Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+spp.+in+food+and+drinking+water+-+A+review.">Acinetobacter spp. in food and drinking water - A review.</a> Food Microbiology. 95, 103675 (2021).</li><li>Towner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter:+an+old+friend,+but+a+new+enemy.">Acinetobacter: an old friend, but a new enemy.</a> Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).</li><li>Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hospital+surfaces+in+the+transmission+of+emerging+health+care-associated+pathogens:+Norovirus,+Clostridium+difficile,+and+Acinetobacter+species.">Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species.</a> American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix:+multitasking+in+a+shared+space.">The biofilm matrix: multitasking in a shared space.</a> Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li><li>Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+the+microbial+&amp;#34;protective+clothing&amp;#34;+in+extreme+environments.">Biofilms: the microbial &amp;#34;protective clothing&amp;#34; in extreme environments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).</li><li>Gedefie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+biofilm+formation+and+its+role+in+disease+pathogenesis:+a+review.">Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review.</a> Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).</li><li>Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii.">Acinetobacter baumannii.</a> Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).</li><li>Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii.">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii.</a> New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).</li><li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+on+biofilm+methods.">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li><li>Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+characteristics+and+transcriptomic+profiling+of+Acinetobacter+johnsonii+defines+signatures+for+planktonic+and+biofilm+cells.">Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells.</a> Environmental Research. 213, 113714 (2022).</li><li>Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii:+genotype-phenotype+correlation.">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation.</a> Molecules. 24 (10), 1849 (2019).</li><li>Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-formation+in+clonally+unrelated+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+isolates.">Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates.</a> Pathogens. 9 (8), 630 (2020).</li><li>Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+role+of+Acinetobacter+and+Bacillus+for+Escherichia+coli+O157:H7+in+biofilms+against+sodium+hypochlorite+and+extracellular+matrix-degrading+enzymes.">Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes.</a> Food Microbiology. 109, 104125 (2023).</li><li>Stepanovi&#263;, S., &#262;irkovi&#263;, I., Ranin, L., Svabi&#263;-Vlahovi&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+Salmonella+spp.+and+Listeria+monocytogenes+on+plastic+surface.">Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface.</a> Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).</li><li>Boone, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+virulence+phenotypes+and+antibiotic+resistance+in+clinical+strains+of+Acinetobacter+baumannii+isolated+in+Nashville,+Tennessee.">Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee.</a> BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).</li><li>Otter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-attached+cells,+biofilms+and+biocide+susceptibility:+implications+for+hospital+cleaning+and+disinfection.">Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection.</a> Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).</li><li>Ravishankar, S., Juneja, V. K., Yousef, A. E., Juneja, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+or+resistance+responses+of+microorganisms+to+stresses+in+the+food+processing+environment.">Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment.</a> Microbial Stress Adaptation and Food Safety. , (2003).</li><li>Dewanti, R., Wong, A. C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+culture+conditions+on+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+O157:H7.">Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7.</a> International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).</li><li>McConnell, M. J., Actis, L., Pach&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii:+human+infections,+factors+contributing+to+pathogenesis+and+animal+models.">Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).</li><li>McQueary, C. N., Actis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+biofilms:+variations+among+strains+and+correlations+with+other+cell+properties.">Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties.</a> The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Utilizando el protocolo descrito, se midió y visualizó la formación de biopelículas de aislados de Acinetobacter en diversos grados y se estimaron las células viables en las biopelículas (Figura 1, Figura 2 y Figura 3).
En este protocolo, se utilizaron dos temperaturas diferentes, 30 °C para el crecimiento y 25 °C para la formación de biopelículas de Acinetobacter. Se utilizó ...

Se sabe que Acinetobacter causa infecciones nosocomiales, y su infección en humanos, especialmente en centros de salud, se reporta cada vez más1. Está muy extendido en hospitales, centros de salud y entornos asociados a los alimentos 2,3,4. Puede sobrevivir durante un largo período en entornos que incluyen superficies hospitalarias como barandillas de camas, mesitas de noche, la superficie de ventiladores y lavabos4. Tal persistencia en las superficies ambientales puede ser uno de los factores significativos que contribuyen a las infecciones nosocomiales de Acinetobacter4.
El biofilm es una forma de vida microbiana y es una matriz microbiana compuesta por células microbianas vivas y sustancias poliméricas extracelulares (EPS) de las células5. Las células microbianas están incrustadas en la matriz y, a menudo, son altamente resistentes a las tensiones ambientales como el calor, las sales, la sequedad, los antibióticos, los desinfectantes y las fuerzas de cizallamiento 6,7.
Acinetobacter puede formar biopelículas en las superficies, lo que sugiere que puede contribuir a una mayor supervivencia en las superficies ambientales, incluidas las superficies hospitalarias, y a una mayor resistencia al tratamiento con antibióticos 8,9. Además, la formación de biopelículas de Acinetobacter podría estar altamente asociada con los resultados clínicos humanos8. Por lo tanto, la formabilidad de la biopelícula de las cepas de Acinetobacter podría ser uno de los indicadores en la predicción de la supervivencia ambiental y de las infecciones humanas 8,10.
Las biopelículas adheridas a la superficie se pueden cuantificar y visualizar para evaluar la formabilidad de la biopelícula. Para cuantificar las biopelículas adheridas a la superficie, las biopelículas normalmente se tiñen con colorantes que tiñen la biopelícula, como el violeta cristalino, y los colorantes se eluyen en solución y se mide la densidad óptica11. La visualización de biopelículas es otro buen enfoque para evaluar la conformabilidad de las biopelículas11. El método de visualización de microscopía de barrido láser confocal (CLSM) que emplea especificidad utilizando colorantes fluorescentes podría ser más útil para caracterizar la morfología de la biopelícula en comparación con otras técnicas como SEM12,13.
Las células viables en las biopelículas se pueden contar para estimar el número de células viables en las biopelículas11. Las células viables incrustadas en las biopelículas se desprenden, se diluyen, se esparcen en placas de agar, se incuban y se enumeran. Debido a que es probable que el mayor número de células cumpla con la dosis infecciosa, puede proporcionar información más detallada sobre las biopelículas, como los potenciales de infección asociados con el número de células13,14.
Este artículo presenta protocolos paso a paso para (1) cuantificar las biopelículas adheridas a la superficie, (2) contar las células viables en las biopelículas y (3) visualizar las biopelículas utilizando CLSM de Acinetobacter. Los protocolos presentados describen los métodos para evaluar la conformabilidad de las biopelículas de los aislados de Acinetobacter y caracterizar sus biopelículas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td>Polystyrene 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>1.10493.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Agar Base Plate</td>
			<td>KisanBio</td>
			<td>MB-B1005-P50</td>
			<td>Growth media for Acinetobacter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMagar Acinetobacter</td>
			<td>CHROMagar</td>
			<td>AC092</td>
			<td>Selective plate for Acinetobacter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V5265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L10316</td>
			<td>SYTO9 and propidium iodide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 PRO NanoQuant</td>
			<td>Biofilm measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Glass Plating Beads</td>
			<td>RBC</td>
			<td>RG001</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-Plate 96 Well Black</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>89621</td>
			<td>Microplate intended for CLSM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification, viability assessment, and visualization strategies for acinetobacter biofilms

Acinetobacter causa infecciones nosocomiales y su formación de biopelículas puede contribuir a la supervivencia en superficies secas como entornos hospitalarios. Por lo tanto, la cuantificación y visualización de biopelículas son métodos importantes para evaluar el potencial de las cepas de Acinetobacter para causar infecciones nosocomiales. Las biopelículas que se forman en la superficie de la microplaca se pueden cuantificar en términos de volumen y número de células. Los volúmenes de biopelícula se pueden cuantificar mediante tinción con violeta cristalino, lavado, decoloración con etanol y luego midiendo el colorante solubilizado con un lector de microplacas. Para cuantificar el número de células incrustadas en las biopelículas, las biopelículas se desechan utilizando raspadores celulares, se cosechan en la solución salina, se agitan vigorosamente en presencia de perlas de vidrio y se esparcen en agar Acinetobacter. A continuación, las placas se incuban a 30 °C durante 24-42 h. Después de la incubación, las colonias rojas se enumeran para estimar el número de células en las biopelículas. Este método de recuento viable también puede ser útil para contar células de Acinetobacter en biopelículas de especies mixtas. Las biopelículas de Acinetobacter se pueden visualizar utilizando tintes fluorescentes. Se emplea una microplaca disponible en el mercado diseñada para el análisis microscópico para formar biopelículas. A continuación, las biopelículas adheridas a la superficie inferior se tiñen con colorantes de yoduro de propidio y SYTO9, se lavan y luego se visualizan con microscopía de barrido láser confocal.

Acinetobacter is known to cause nosocomial infections, and its human infection, especially in healthcare facilities, is increasingly reported1. It is widespread in hospitals, healthcare facilities, and food-associated environments2,3,4. It can survive for a long period in environments including hospital surfaces such as bed rails, bedside tables, the surface of ventilators, and sinks4. Such persistence on environmental surfaces may be one of the significant factors contributing to the nosocomial infections of Acinetobacter4.
Biofilm is a form of microbial life and is a microbial matrix composed of live microbial cells and extracellular polymeric substances (EPS) from the cells5. The microbial cells are embedded in the matrix and are often highly resistant to environmental stresses such as heat, salts, dryness, antibiotics, disinfectants, and shear forces6,7.
Acinetobacter can form biofilms on surfaces, suggesting that it may contribute to extended survival on environmental surfaces, including hospital surfaces, and enhanced resistance to antibiotic treatment8,9. In addition, the biofilm formation of Acinetobacter could be highly associated with human clinical outcomes8. Therefore, the biofilm formability of Acinetobacter strains could be one of the indicators in predicting environmental survival and human infections8,10.
The surface-attached biofilms can be quantified and visualized to assess biofilm formability. To quantify surface-attached biofilms, the biofilms are normally stained by biofilm-staining dyes such as crystal violet, and the dyes are eluted in solution and measured for optical density11. Visualization of biofilms is another good approach to assess biofilm formability11. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) visualization method employing specificity using fluorescent dyes could be more useful to characterize biofilm morphology compared to other techniques such as SEM12,13.
The viable cells in biofilms can be counted to estimate the number of viable cells in biofilms11. The viable cells embedded in biofilms are detached, diluted, spread on agar plates, incubated, and enumerated. Because the higher number of cells is likely to meet the infectious dose, it can provide more detailed information on biofilms, such as infection potentials associated with the number of cells13,14.
This article presents step-by-step protocols to (1) quantify surface-attached biofilms, (2) count viable cells in the biofilms, and (3) visualize the biofilms using CLSM of Acinetobacter. The presented protocols describe the methods to assess the biofilm formability of Acinetobacter isolates and characterize their biofilms.

Autor destacado: Un protocolo integral para la cuantificación, evaluación y visualización de biopelículas de Acinetobacter 

Estrategias de cuantificación, evaluación de viabilidad y visualización de biopelículas de Acinetobacter

Biofilms are composed of live microbial cells and are difficult to remove from the surfaces. Acinetobacter strains commonly found in our environment, causing nosocomial infections, are also known to form biofilms on surfaces. So, we aim to develop methods to both quantify and visualize Acinetobacter biofilms.Our protocol provides a simple and easy method to quantify and visualize the biofilms of Acinetobacter. The viable number of cells inside the biofilms is quantified by using the viable count method. Our research findings reveal that the naturally-existing Acinetobacter vector strains have quite varying potentials for biofilm formation.Also, there will exist distinct morphological differences within the various biofilms. This paved the way for research focusing on the causes of such a large variation among Acinetobacter strains.

Siguiendo el protocolo, las biopelículas de aislados de Acinetobacter , originalmente aisladas de las superficies de la cocina, se formaron en una placa de poliestireno de 96 pocillos, teñida con violeta cristalino, y los colorantes se solubilizaron en etanol y se midió la masa de la biopelícula (Figura 1). El número de biopelículas varió mucho en función de las cepas, oscilando entre 0,04 y 1,69 DO (Figura 1). Con base en los criterios establec...

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Este protocolo describe la preparación del inóculo, la cuantificación de la biopelícula en placas de microtitulación utilizando colorante violeta cristalino, el recuento viable en biopelículas y la visualización de biopelículas de Acinetobacter.

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

Las biopelículas están compuestas por células microbianas vivas y son difíciles de eliminar de las superficies. También se sabe que las cepas de Acinetobacter que se encuentran comúnmente en nuestro medio ambiente, que causan infecciones nosocomiales, forman biopelículas en las superficies. Por lo tanto, nuestro objetivo es desarrollar métodos para cuantificar y visualizar las biopelículas de Acinetobacter.Nuestro protocolo proporciona un método simple y fácil para cuantificar y visualizar las biopelículas de Acinetobacter. El número viable de células dentro de las biopelículas se cuantifica utilizando el método de recuento de viables. Los resultados de nuestra investigación revelan que las cepas de vectores Acinetobacter existentes de forma natural tienen un potencial bastante variable para la formación de biopelículas.Además, existirán claras diferencias morfológicas dentro de las distintas biopelículas. Esto allanó el camino para la investigación centrada en las causas de una variación tan grande entre las cepas de Acinetobacter.

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Research

JoVE Journal

Biology

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

1.4K vistas.  Korea Food Research Institute. Las biopelículas están compuestas por células microbianas vivas y son difíciles de eliminar de las superficies. También se sabe que las cepas de Acinetobacter que se encuentran comúnmente en nuestro medio ambiente, que causan infecciones nosocomiales, forman biopelículas en las superficies. Por lo tanto, nuestro objetivo es desarrollar métodos para cuantificar y visualizar las biopelículas de Acinetobacter.Nuestro protocolo proporciona un método simple y fácil para cuantific...

Video: Autor destacado: Un protocolo integral para la cuantificación, evaluación y visualización de biopelículas de Acinetobacter 

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

Investigación

Biología

Preparation of Bacterial Inoculum for Acinetobacter Biofilm Formation

Preparation of Bacterial Inoculum for Acinetobacter Biofilm Formation  

To begin the process of bacterial inoculum preparation, collect 2 to 10 microliters of the bacterial strain from the vial, using a sterile pipette tip, and inoculate a commercially-available blood agar plate with it. Using a sterile loop, streak the agar surface, thinning it out with intermittent flaming. Incubate the prepared agar plate in an upside-down position at 30 degrees Celsius for about 20 to 24 hours.Next, select a single colony of the bacterial culture with a sterile needle and inoculate five milliliters of sterile BHI broth with this culture. Incubate the inoculated broth in a shaking incubator at 30 degrees Celsius at a speed of 150 rotations per minute for about 20 to 24 hours. Then transfer one milliliter of the culture to a sterile micro-centrifuge tube and centrifuge at 6, 000 g and room temperature for 10 minutes.Following centrifugation, discard the supernatant. Add one milliliter of sterile phosphate-buffered saline, or PBS, to the pellet, and re-suspend it using a vortex. Centrifuge the re-suspended pellet at 6, 000 g for 10 minutes at room temperature and discard the supernatant.This time re-suspend the resulting pellet in sterile, tenfold-diluted BHI broth using vortex. Ensure to achieve an optical density of around 0.1 at 600 nanometers.

Preparación de inóculo bacteriano para la formación de biopelículas de Acinetobacter

Acinetobacter Biofilm Quantification Using Crystal Violet

Acinetobacter Biofilm Quantification Using Crystal Violet  

To begin, add 200 microliters of the bacterial inoculum to each well of a sterile polystyrene 96-well plate. Then add 200 microliters of deionized water into the outermost wells to keep the inner wells from drying out. Incubate the 96-well plate at 25 degrees Celsius for 24 hours.Following incubation, discard the supernatant in each well using a pipette. Carefully add 300 microliters of PBS to each well and remove the PBS again by using the pipette. Add 200 microliters of 1%crystal violet solution to each well before incubating the plate at room temperature for 30 minutes.Then after dispensing 200 microliters of absolute ethanol in each well, leave the plate for 15 minutes at room temperature. Ensure thorough mixing by pipetting the contents in each well up and down repeatedly. Using a microplate reader, measure the absorbance of the wells at 595 nanometers to determine the biofilm mass.The number of biofilms varied greatly depending on the strains, ranging from an optical density or OD value of 0.04 to 1.69 All of the Acetobacter isolates, except for A.bouvetii, formed biofilms, while A.radioresistens formed a weak biofilm. A.junii and A.baumannii formed moderate biofilms, and A.pittii and A.ursingii formed strong biofilms.

Acinetobacter Cuantificación de biopelículas mediante cristal violeta

Assessing Acinetobacter Biofilm Viability Count

Assessing Acinetobacter Biofilm Viability Count  

Begin by adding one milliliter of the bacterial inoculum to each well of a sterile polystyrene 12 well plate. Incubate the plate at 25 degrees Celsius for 24 hours. Then, remove the supernatant using a pipette.Carefully add 1.5 milliliters of sterile phosphate buffered saline or PBS to each well, and again, remove the supernatant with the pipette. After adding one milliliter of sterile PBS to each well once more, use fitted cell scrapers to scrape off the bottom and wall surfaces of the wells. Transfer the harvested cell suspension to a sterile plastic tube marked as 10 to the negative one containing nine milliliters of saline and 10 to 20 glass beads.Vortex the tube for 60 seconds at maximum speed. Next, perform a tenfold serial dilution by transferring one milliliter of the cell suspension from the previous tube to another sterile tube marked 10 to the negative two containing nine milliliters of saline solution. Continue this process of serial dilution up to tube 10 to the negative seven.Spread 100 microliters from each dilution onto separate acinetobacter agar plates. Incubate the agar plates at 30 degrees Celsius for 24 to 42 hours. Then count the number of typical red colonies on each plate manually, considering those within the range between 10 and 250.All the acinetobacter isolates except for A.bouvetii had cells equivalent to seven to eight log CFU per well in their biofilms. While A.bouvetii had a much lower cell number at 4.4 Log CFU.

Evaluación del recuento de viabilidad de la biopelícula de Acinetobacter

Acinetobacter Biofilm Visualization by Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)

Begin by adding 200 microliters of bacterial inoculum into each well of a sterile 96-well plate prepared for microscopic analysis. Incubate the plate at 25 degrees Celsius for 24 hours before removing the supernatant with the pipette. Next, carefully add 300 microliters of filter-sterilized deionized water into each well.Remove the supernatant using a pipette once again. In another tube, prepare a diluted mixture of SYTO 9 and propidium iodide and filter-sterilized deionized water to the respective desired final concentrations. Then add 200 microliters of the mixture into each well and incubate the plate for 20 to 30 minutes at room temperature in a dark setting.Confocal laser scanning microscopy revealed that biofilm formation significantly varied depending on the strains. A substantial amount of biofilm was found in Acinetobacter junii, Acinetobacter baumannii, and Acinetobacter ursingii with distinct biofilm morphologies.